SDS-PAGE — метод электрофореза, который разделяет белки по молекулярной массе и даёт результат в виде видимых глазом полос. Название образовано от используемого детергента и среды разделения: электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Поскольку это самый практичный способ увидеть, на сколько групп по массе распределяется смесь белков, метод широко применяется в лабораториях.
Несмотря на то что метод используют уже десятилетиями, он сохраняет своё место. Он относительно прост в постановке, не требует дорогого оборудования, а результат можно оценить непосредственно глазом. Первое представление о степени чистоты образца или о присутствии неожиданного компонента зачастую даёт именно этот метод.
Принцип метода
В нативном состоянии белки свёрнуты по-разному и несут разный суммарный заряд. Эти две переменные не позволяют разделять их только по размеру. SDS решает проблему с двух сторон: разворачивает молекулу, устраняя укладку, и, связываясь с цепью пропорционально её массе, придаёт каждому белку сходную плотность отрицательного заряда. В результате движение в электрическом поле определяется главным образом размером молекулы.
Среда разделения — пористая сетка из полиакриламида. Малые молекулы легко проходят сквозь неё и продвигаются дальше, а крупные тормозятся трением и отстают. В итоге между расстоянием миграции и логарифмом молекулярной массы устанавливается приблизительно линейная зависимость. Доля акриламида в геле определяет размер пор: гели с высокой долей лучше разделяют малые белки, с низкой — крупные.
На практике гель обычно готовят двухслойным. Верхний, разреженный (концентрирующий) слой собирает белки из разных лунок в тонкую линию; собственно разделение происходит в нижнем, плотном слое. Такая схема обеспечивает чёткость полос. Ток и продолжительность подбирают вместе, чтобы гель не перегревался во время электрофореза.
Этапы электрофореза
- Образец смешивают с детергентом и буфером для нанесения; при добавлении восстанавливающего компонента дисульфидные мостики разрываются.
- Смесь кратковременно нагревают, завершая денатурацию.
- В лунки геля вносят образцы и маркер молекулярных масс.
- Прикладывают электрическое поле; белки, несущие отрицательный заряд, мигрируют к положительному полюсу.
- Проводят окрашивание; распространённый вариант — белковые красители, окрашивающие гель в синий цвет, для малых количеств используют более чувствительные методы.
- Избыток красителя удаляют, гель визуализируют и оценивают картину полос.
Выбор окрашивания определяет минимальное количество, которое можно увидеть. Распространённые синие красители удобны и недороги, но могут пропустить полосы низкой концентрации; более чувствительные методы делают видимыми минорные компоненты, но более трудоёмки. Поэтому отсутствие полосы не означает, что компонента такой массы нет.
Маркер и определение массы
Маркер молекулярных масс — смесь белков с известной молекулярной массой, образующая в геле своего рода эталонную линейку. Сравнивая положение полос образца с этой линейкой, определяют приблизительную массу. При анализе референсной партии использован маркер в диапазоне от 10 до 250 килодальтон; основная масса белка образца наблюдалась в диапазоне 10–25 килодальтон, а около 37 килодальтон зарегистрирована выраженная полоса.
| Наблюдение | Возможное значение |
|---|---|
| Чёткая одиночная полоса | Доминирующий компонент или узкая группа масс |
| Множество тонких полос | Смесь распределена по широкому диапазону масс |
| Размытая полоса | Перегрузка или проблема с условиями электрофореза |
| Скопление на дне лунки | Нерастворившийся или агрегированный материал |
| Отсутствие полосы | Недостаточное нанесение или количество ниже чувствительности окрашивания |
На результат влияет и количество нанесённого образца. При анализе референсной партии образец нанесён серией от 5 до 30 микрограммов; это позволяет найти диапазон, в котором слабые полосы уже видны, а интенсивные ещё не сливаются.
На что обращать внимание при работе с ядом
Наиболее интересные пептиды яда очень малы и в стандартных гелях оказываются у нижней границы; поэтому предпочитают гели с высокой долей акриламида или буферные системы, подходящие для малых молекул. Второй момент — этап восстановления: поскольку при разрыве дисульфидных мостиков подвижность пептида может меняться, условия с восстановителем и без него оценивают отдельно. Роль мостиков в структуре объясняется в статье о дисульфидных мостиках. Чтобы правильно выбрать количество для нанесения, общее содержание белка в образце нужно измерить заранее; это измерение рассматривается в статье об определении белка по калибровочной кривой.
В отчёте вместе с изображением геля приводят условия электрофореза: долю акриламида в геле, использованный маркер, наличие восстановления и количество нанесённого образца. Без этих сведений картину полос нельзя сравнить с результатами другой работы. Для последующих оценок также необходимо хранить изображение в масштабированном и необработанном виде.
Чего метод не говорит?
Электрофорез даёт кажущуюся молекулярную массу, а не точное значение массы. Распределение заряда, остатки укладки или связанные с молекулой углеводные группы могут влиять на миграцию и давать положение, отличное от ожидаемого. В одной полосе может находиться и несколько компонентов. Для получения точной массы и сведений о последовательности переходят к таким методам, как масс-спектрометрия. Поэтому электрофорез используют не как самостоятельный решающий тест, а как слой данных, который читают вместе с хроматографией и спектроскопией. Точки, в которых три метода подтверждают друг друга, служат основой оценки партии, а расхождения — поводом для повторного измерения. Результаты по партиям публикуются на странице анализа.
