SDS-PAGE طريقة رحلان كهربائي تفصل البروتينات بحسب أوزانها الجزيئية وتعطي النتيجة على هيئة حزم مرئية بالعين. واسمها مأخوذ من الحروف الأولى للمنظف المستخدم ولوسط الفصل: دوديسيل كبريتات الصوديوم، والرحلان الكهربائي على هلام متعدد الأكريلاميد. وتُستخدم على نطاق واسع في المختبرات لأنها أعملُ طريقة لمعرفة عدد مجموعات الوزن التي يتوزع عليها مخلوط بروتيني.
ولا تزال الطريقة تحافظ على مكانها رغم استخدامها منذ عقود. فتنصيبها بسيط نسبيًا، ولا تحتاج جهازًا باهظًا، ويمكن تقييم نتيجتها بالعين مباشرة. وكثيرًا ما تعطي هذه الطريقة الفكرة الأولى عن مستوى نقاوة عيّنة، أو عمّا إذا كانت تحوي مكوّنًا غير متوقع.
مبدأ الطريقة
البروتينات في حالتها الطبيعية مطوية بأشكال مختلفة، والشحنة الصافية التي تحملها متباينة. وهذان المتغيران يجعلان الفصل على أساس الحجم وحده مستحيلًا. ويحل SDS هذه المشكلة من وجهين: فهو يفرد الجزيء فيزيل الطي، ويرتبط بالسلسلة ارتباطًا متناسبًا مع الكتلة فيمنح كل بروتين كثافة شحنة سالبة متقاربة. وبذلك تبقى الحركة في المجال الكهربائي مرهونة أساسًا بحجم الجزيء.
ووسط الفصل شبكة مسامية من متعدد الأكريلاميد. فالجزيئات الصغيرة تعبر هذه الشبكة بسهولة وتتقدم بعيدًا، أما الكبيرة فتتعثر بالاحتكاك وتتخلف. وينشأ في النهاية ارتباط خطي تقريبي بين مسافة الهجرة ولوغاريتم الوزن الجزيئي. ونسبةُ الأكريلاميد في الهلام هي التي تحدد حجم المسام: فالهلاميات العالية النسبة تفصل البروتينات الصغيرة فصلًا أفضل، والمنخفضة النسبة تفصل الكبيرة.
ويُحضَّر الهلام في التطبيق من طبقتين في الغالب. فالطبقة العلوية المتخلخلة تجمع البروتينات الآتية من الآبار المختلفة في خط رفيع؛ أما الفصل الحقيقي فيجري في الطبقة السفلية الكثيفة. وهذا الترتيب يجعل الحزم حادة. ويُضبط التيار والزمن معًا أثناء التشغيل حتى لا يسخن الهلام.
خطوات التشغيل
- تُمزج العيّنة مع المنظف ومحلول التحميل؛ وإذا أُضيف مكوّن مختزل انفتحت الجسور ثنائية الكبريتيد.
- يُسخَّن المخلوط مدة قصيرة فيكتمل التمسخ.
- تُحمَّل العيّنات وسلّمٌ معياري في آبار الهلام.
- يُطبَّق المجال الكهربائي؛ وتهاجر البروتينات نحو القطب الموجب لأنها مشحونة سالبًا.
- يُجرى التلوين؛ والخيار الشائع صبغات البروتين التي تلوّن الهلام بالأزرق، وتُستخدم للكميات المنخفضة طرق أكثر حساسية.
- تُزال الصبغة الزائدة ويُصوَّر الهلام لتقييم أنماط الحزم.
واختيار التلوين هو الذي يحدد أدنى كمية يمكن رؤيتها. فالصبغات الزرقاء الشائعة عملية ورخيصة لكنها قد تفوّت الحزم المنخفضة التركيز؛ أما الطرق الأكثر حساسية فتُظهر المكوّنات القليلة، غير أن تطبيقها شاقّ. ولهذا فإن عدم رؤية حزمة لا يعني أنه لا يوجد مكوّن عند ذلك الوزن.
السلّم وقراءة الوزن
السلّم المعياري مخلوط من بروتينات معلومة الأوزان الجزيئية، ويشكّل مسطرة مرجعية على الهلام. ويُحدَّد الوزن التقريبي بمقارنة مواضع حزم العيّنة بهذه المسطرة. وفي تحليل الدفعة المرجعية استُخدم سلّم يغطي المدى بين 10 و 250 كيلو دالتون، ولوحظ أن كثافة البروتين الرئيسية في العيّنة تقع في مجال 10-25 كيلو دالتون، وسُجّلت حزمة واضحة عند نحو 37 كيلو دالتون.
| الملاحظة | المعنى المحتمل |
|---|---|
| حزمة واحدة حادة | مكوّن مهيمن أو مجموعة وزن ضيقة |
| حزم رفيعة كثيرة | توزّع المخلوط على مجال وزن واسع |
| حزمة متسعة | تحميل مفرط أو خلل في ظروف التشغيل |
| تراكم في قاع البئر | مادة غير ذائبة أو متكتلة |
| غياب الحزم | تحميل غير كافٍ أو بقاء دون حساسية التلوين |
ومقدار التحميل يؤثر في النتيجة أيضًا. ففي تحليل الدفعة المرجعية حُمِّلت العيّنة على هيئة سلسلة تتراوح بين 5 و 30 ميكروغرامًا؛ وبذلك أمكن ملاحظة المجال الذي تظهر فيه الحزم الضعيفة ولا تطفح فيه الحزم الكثيفة.
ما يُنتبَه إليه في عيّنات السم
ببتيدات السم المثيرة للاهتمام صغيرة جدًا وتبقى قريبة من الحد الأدنى في الهلاميات المعيارية؛ ولهذا تُفضَّل الهلاميات العالية نسبةِ الأكريلاميد أو أنظمة المحاليل المنظِّمة الملائمة للجزيئات الصغيرة. والنقطة الثانية هي خطوة الاختزال: فلأن سلوك هجرة الببتيد قد يتغير عند فتح الجسور ثنائية الكبريتيد، تُقيَّم الظروف مع عامل مختزل وبدونه كلٌّ على حدة. ودور الجسور في البنية مشروح في مقال الجسور ثنائية الكبريتيد. ولكي يُختار مقدار التحميل اختيارًا صحيحًا يلزم قياس حمولة البروتين الكلية في العيّنة مسبقًا؛ وهذا القياس متناوَل في مقال تحديد البروتين بالمنحنى المعياري.
وعند إعداد التقرير تُعطى ظروف التشغيل إلى جانب صورة الهلام: نسبة الأكريلاميد في الهلام، والسلّم المستخدم، وحالة الاختزال، ومقدار التحميل. وبدون هذه المعلومات لا يمكن مقارنة نمط الحزم بنتيجة دراسة أخرى. كما أن حفظ الصورة بمقياس ودون معالجة ضروري للتقييمات التي تُجرى لاحقًا.
ما الذي لا تقوله الطريقة؟
القيمة التي يعطيها الرحلان الكهربائي هي الوزن الجزيئي الظاهر، لا الكتلة القاطعة. فتوزّع الشحنة، أو بقايا الطي، أو المجموعات السكرية المرتبطة بالجزيء قد تؤثر في الهجرة فتُنتج موضعًا مختلفًا عن المتوقع. وقد يوجد أكثر من مكوّن في الحزمة الواحدة. وللحصول على الكتلة القاطعة ومعلومات التسلسل يُنتقل إلى طرق مثل مطيافية الكتلة. ولهذا يُستخدم الرحلان الكهربائي لا بوصفه اختبارًا يحسم وحده، بل بوصفه طبقة تُقرأ مع الكروماتوغرافيا والمطيافية. فالنقاط التي تتأكد فيها الطرق الثلاث بعضها ببعض تشكّل سند التقييم المُعطى عن دفعة؛ أما النقاط التي تتباين فيها فهي سبب لإعادة القياس. وتُنشر النتائج على أساس الدفعة في صفحة التحليل.
