SDS-PAGE, proteinleri molekül ağırlıklarına göre ayıran ve sonucu gözle görülebilir bantlar hâlinde veren bir elektroforez yöntemidir. Adı, kullanılan deterjan ile ayrım ortamının baş harflerinden gelir: sodyum dodesil sülfat ve poliakrilamid jel elektroforezi. Bir protein karışımının kaç ağırlık grubuna dağıldığını görmenin en pratik yolu olduğu için laboratuvarlarda yaygın biçimde kullanılır.
Yöntem, onlarca yıldır kullanılmasına rağmen yerini koruyor. Kurulumu görece basittir, pahalı bir cihaz gerektirmez ve sonucu doğrudan gözle değerlendirilebilir. Bir numunenin saflık düzeyi ya da beklenmeyen bir bileşen içerip içermediği hakkında ilk fikri çoğu zaman bu yöntem verir.
Yöntemin ilkesi
Proteinler doğal hâllerinde farklı biçimlerde katlanmıştır ve taşıdıkları net yük birbirinden farklıdır. Bu iki değişken, ayrımı yalnızca boy üzerinden yapmayı imkânsız kılar. SDS bu sorunu iki yönden çözer: molekülü açarak katlanmayı ortadan kaldırır ve zincire kütleyle orantılı biçimde bağlanarak her proteine benzer bir negatif yük yoğunluğu kazandırır. Böylece elektrik alanında hareket, esas olarak molekülün büyüklüğüne bağlı kalır.
Ayrım ortamı, poliakrilamidden oluşan gözenekli bir ağdır. Küçük moleküller bu ağın içinden kolayca geçip uzağa ilerler, büyük moleküller ise sürtünmeye takılarak geride kalır. Sonuçta göç mesafesi ile molekül ağırlığının logaritması arasında yaklaşık doğrusal bir ilişki kurulur. Jelin akrilamid oranı gözenek boyutunu belirler: yüksek oranlı jeller küçük proteinleri, düşük oranlı jeller büyükleri daha iyi ayırır.
Uygulamada jel çoğunlukla iki katmanlı hazırlanır. Üstteki seyrek katman, farklı kuyucuklardan gelen proteinleri ince bir hat hâlinde toplar; asıl ayrım alttaki sık katmanda gerçekleşir. Bu düzen bantların keskin çıkmasını sağlar. Yürütme sırasında jelin ısınmaması için akım ve süre birlikte ayarlanır.
Bir yürütmenin adımları
- Numune, deterjan ve yükleme tamponuyla karıştırılır; indirgeyici bir bileşen eklenirse disülfit köprüleri açılır.
- Karışım kısa süre ısıtılarak denatürasyon tamamlanır.
- Jelin kuyucuklarına numuneler ve bir standart merdiven yüklenir.
- Elektrik alanı uygulanır; proteinler negatif yüklü oldukları için artı kutba doğru göç eder.
- Boyama yapılır; yaygın seçenek jeli mavi boyayan protein boyalarıdır, düşük miktarlar için daha duyarlı yöntemler kullanılır.
- Fazla boya giderilir ve jel görüntülenerek bant desenleri değerlendirilir.
Boyama seçimi, görülebilecek en düşük miktarı belirler. Yaygın mavi boyalar pratik ve ucuzdur ama düşük derişimdeki bantları kaçırabilir; daha duyarlı yöntemler az miktardaki bileşenleri görünür kılar, buna karşılık uygulaması zahmetlidir. Bu nedenle bir bandın görülmemesi, o ağırlıkta bileşen bulunmadığı anlamına gelmez.
Merdiven ve ağırlık okuma
Standart merdiven, molekül ağırlıkları bilinen proteinlerin karışımıdır ve jelde bir referans cetveli oluşturur. Numune bantlarının konumu bu cetvelle karşılaştırılarak yaklaşık ağırlık belirlenir. Referans parti analizinde 10 ile 250 kilodalton arasını kapsayan bir merdiven kullanılmış, numunenin ana protein yoğunluğu 10-25 kilodalton aralığında gözlenmiş ve 37 kilodalton dolayında belirgin bir bant kaydedilmiştir.
| Gözlem | Olası anlamı |
|---|---|
| Keskin ve tek bant | Baskın bir bileşen ya da dar bir ağırlık grubu |
| Çok sayıda ince bant | Karışımın geniş bir ağırlık aralığına dağıldığı |
| Yayvan bant | Aşırı yükleme ya da yürütme koşullarında sorun |
| Kuyucuk dibinde birikme | Çözünmemiş ya da kümelenmiş materyal |
| Bant yokluğu | Yetersiz yükleme ya da boyama duyarlılığının altında kalma |
Yükleme miktarı da sonucu etkiler. Referans parti analizinde numune, 5 ile 30 mikrogram arasında değişen bir seri hâlinde yüklenmiştir; böylece hem zayıf bantların görünür olduğu hem de yoğun bantların taşmadığı aralık gözlenebilir.
Venom numunelerinde dikkat edilecekler
Venomun ilgi çeken peptidleri çok küçüktür ve standart jellerde alt sınıra yakın kalır; bu yüzden yüksek akrilamid oranlı jeller ya da küçük moleküllere uygun tampon sistemleri tercih edilir. İkinci nokta indirgeme adımıdır: disülfit köprüleri açıldığında peptidin göç davranışı değişebildiğinden, indirgeyici kullanılan ve kullanılmayan koşullar ayrı ayrı değerlendirilir. Köprülerin yapıdaki rolü disülfit köprüleri yazısında açıklanıyor. Yükleme miktarının doğru seçilebilmesi için numunedeki toplam protein yükünün önceden ölçülmesi gerekir; bu ölçüm standart eğriyle protein tayini yazısında ele alınıyor.
Sonuç raporlanırken jel görüntüsünün yanında yürütme koşulları da verilir: jelin akrilamid oranı, kullanılan merdiven, indirgeme durumu ve yükleme miktarı. Bu bilgiler olmadan bir bant deseni başka bir çalışmanın sonucuyla karşılaştırılamaz. Görüntünün ölçeklendirilmiş ve işlenmemiş hâlde saklanması da sonradan yapılacak değerlendirmeler için gereklidir.
Yöntem neyi söylemez?
Elektroforezin verdiği değer görünür molekül ağırlığıdır, kesin kütle değildir. Yük dağılımı, katlanma kalıntıları ya da moleküle bağlı şeker grupları göçü etkileyerek beklenenden farklı bir konum üretebilir. Aynı bant içinde birden çok bileşen de bulunabilir. Kesin kütle ve dizi bilgisi için kütle spektrometrisi gibi yöntemlere geçilir. Bu nedenle elektroforez, tek başına karar veren bir test olarak değil, kromatografi ve spektroskopiyle birlikte okunan bir katman olarak kullanılır. Üç yöntemin birbirini doğruladığı noktalar, bir parti hakkında verilen değerlendirmenin dayanağını oluşturur; birbirinden ayrıştığı noktalar ise tekrar ölçüm gerekçesidir. Parti bazlı sonuçlar analiz sayfasında yayımlanır.
