Bir çözeltide ne kadar protein bulunduğunu doğrudan okuyan bir cihaz yoktur. Ölçülen şey her zaman dolaylı bir büyüklüktür: çoğunlukla belirli bir dalga boyunda soğurulan ışık miktarı. Bu okumayı miligram cinsinden bir derişime çevirmek için bir dönüşüm kuralı gerekir ve o kural standart eğridir.
Standart eğri, bilinen derişimlerdeki çözeltilerin okunmasıyla elde edilen bir referans çizgisidir. Bilinmeyen numunenin okuması bu çizgi üzerinde karşılığını bulur. Yöntem basit görünür, ancak sonucun güvenilirliği tamamen eğrinin nasıl kurulduğuna bağlıdır.
Protein tayininde birden çok yaklaşım kullanılır. Bir bölümü, proteine bağlanınca rengi değişen bir boya kullanır; bir bölümü bakır iyonlarının protein varlığında indirgenmesine dayanır; en dolaysız yol ise çözeltinin mor ötesi bölgedeki soğurmasını okumaktır. Hangi yol seçilirse seçilsin, okumayı derişime çeviren bir kalibrasyona ihtiyaç duyulur.
Standart seri nasıl hazırlanır?
Önce derişimi bilinen bir referans protein çözeltisi hazırlanır. Bu çözeltiden seri seyreltmelerle, ölçülecek aralığı kapsayan birkaç ara derişim elde edilir. Seri, beklenen numune değerinin hem altını hem üstünü içerecek biçimde tasarlanır; numunenin eğrinin dışına düşmesi, sonucun tahmine dayanması anlamına gelir.
Standartlar ve numune aynı çözücüde, aynı koşullarda ve aynı oturumda okunur. Farklı günlerde hazırlanmış bir eğriyle çalışmak, cihaz ve ortam kaynaklı sapmaları sonuca taşır. Her derişimin birden çok kez okunması ve ortalamanın kullanılması da yaygın uygulamadır.
Standart olarak hangi proteinin kullanıldığı da kayda geçer. Yaygın tercih, saflaştırılmış ve derişimi iyi tanımlanmış bir referans proteindir. Referansın numunedeki proteinlerle birebir aynı davranmadığı bilinir; bu nedenle sonuç, seçilen referansa göre ifade edilen bir eşdeğer değer olarak okunur.
Eğriden denkleme
Okumalar, yatay eksende derişim ve dikey eksende soğurma olacak biçimde işaretlenir. Noktalardan geçen en uygun doğru, doğrusal regresyonla hesaplanır. Sonuç, aşağıdaki biçimde bir denklemdir:
y = eğim × x + kesişim
Buradaki y okunan soğurma, x ise aranan derişimdir. Numune okuması denklemde yerine konup x çözülerek derişim bulunur; sonra varsa seyreltme oranıyla çarpılır. Kesişim değerinin sıfırdan farklı olması olağandır ve çoğunlukla kör okumanın tam olarak sıfır çıkmamasından kaynaklanır.
Ölçümün tekrarı da güvenilirliğin parçasıdır. Her standart ve numune için birden fazla okuma yapılması, tek bir pipetleme hatasının sonucu sürüklemesini engeller. Okumalar arasındaki fark beklenenden büyükse, eğri kabul edilmeden önce hazırlık adımları gözden geçirilir.
R kare değeri ne anlatır?
Belirleme katsayısı, noktaların hesaplanan doğruya ne kadar iyi oturduğunu gösterir. Bire yaklaştıkça uyum iyileşir. Laboratuvar uygulamasında yüksek bir değer, standart serinin düzgün hazırlandığına ve ölçümün doğrusal aralıkta yapıldığına işaret eder.
Yine de tek başına yeterli bir ölçüt değildir. Yüksek bir katsayı, standartların yanlış derişimde hazırlanmış olma ihtimalini ortadan kaldırmaz; yalnızca noktaların birbiriyle tutarlı olduğunu söyler. Bu yüzden değerlendirme, eğrinin grafiğine bakılarak da yapılır: noktaların uçlarda kıvrılması doğrusal aralığın aşıldığını gösterir.
| Öğe | Referans parti raporundaki karşılığı |
|---|---|
| Standart eğri denklemi | y = 0,0011x + 0,1726 |
| Belirleme katsayısı | R² = 0,9903 |
| Bulunan protein konsantrasyonu | 28 mg/mL |
| Ölçümün yapıldığı yer | Tesis dışındaki bağımsız laboratuvar |
Tablodaki değerler tek bir partiye aittir. Her parti için ölçüm yeniden yapılır ve sonuç partiye göre değişebilir; bu nedenle rapor, ürünün değişmez bir özelliği değil belirli bir numunenin künyesi olarak okunur.
Eğrinin belirli aralıklarla yenilenmesi de iyi uygulamanın parçasıdır. Uzun süre önce kurulmuş bir eğriyle çalışmak, cihazın ve çözeltilerin o günden bu yana değişmediğini varsaymak anlamına gelir. Standart çözeltilerin saklama koşulları ve son kullanma bilgileri de bu nedenle kayıt altında tutulur.
Sık karşılaşılan tuzaklar
- Aralık dışı okuma: Numunenin soğurması eğrinin üst sınırını aşarsa sonuç güvenilmez olur; numune seyreltilip ölçüm tekrarlanır.
- Kör seçimi: Kör ölçüm, numuneyle aynı çözücüyle yapılmalıdır; farklı bir çözücü kesişim değerini kaydırır.
- Girişim yapan maddeler: Tampon bileşenleri, deterjanlar ve indirgeyiciler yönteme göre okumayı etkileyebilir.
- Referans protein farkı: Eğri hangi proteinle kurulmuşsa sonuç ona göre ifade edilir; farklı bir referans farklı bir değer verebilir.
- Seyreltme hatası: Küçük hacimlerde yapılan seyreltmelerde pipetleme hatası doğrudan sonuca yansır.
Sonucun nasıl bildirildiği de önemlidir. Derişim çoğunlukla mililitredeki miligram cinsinden verilir; toplam protein miktarı istendiğinde bu değer hacimle çarpılır. Rapor, sayının yanında yöntemi, kullanılan referans proteini ve ölçüm koşullarını da içerir. Bu bilgiler olmadan iki laboratuvarın sonucu doğrudan karşılaştırılamaz.
Sonuç nerede kullanılır?
Protein derişimi, kendi başına bir sayı olmanın ötesinde sonraki analizlerin girdisidir. Elektroforezde jele ne kadar numune yükleneceği bu değere göre belirlenir; yöntemin ayrıntısı SDS-PAGE yazısında anlatılıyor. Soğurma ölçümünün fiziksel temeli ise UV-Vis yazısında ele alınmıştır.
Değer, parti künyesinin de bir parçasıdır ve analiz sertifikasında yöntemiyle birlikte bildirilir; sertifikanın okunması CoA yazısında anlatılıyor. Ölçümün tesis dışında, bağımsız bir laboratuvarda yapılması da sonucun değerlendirilmesinde ayrı bir ağırlık taşır. Parti bazlı sonuçlarımız analiz sayfasında yayımlanır.
