Прибора, который напрямую показывал бы, сколько белка содержится в растворе, не существует. Измеряется всегда косвенная величина — чаще всего количество света, поглощённого при определённой длине волны. Чтобы перевести это показание в концентрацию в миллиграммах, нужно правило пересчёта, и этим правилом служит калибровочная кривая.
Калибровочная кривая — это референсная линия, полученная измерением растворов с известными концентрациями. Показание неизвестного образца находит на этой линии своё соответствие. Метод выглядит простым, однако надёжность результата целиком зависит от того, как построена кривая.
Для определения белка применяют несколько подходов. Одни основаны на красителе, который меняет цвет при связывании с белком; другие — на восстановлении ионов меди в присутствии белка; самый прямой путь — измерение поглощения раствора в ультрафиолетовой области. Какой бы путь ни был выбран, нужна калибровка, переводящая показание в концентрацию.
Как готовят серию стандартов?
Сначала готовят раствор референсного белка известной концентрации. Из него последовательными разведениями получают несколько промежуточных концентраций, охватывающих измеряемый диапазон. Серию планируют так, чтобы она включала значения как ниже, так и выше ожидаемого значения образца: если образец выходит за пределы кривой, результат становится оценочным.
Стандарты и образец измеряют в одном и том же растворителе, в одинаковых условиях и в одном сеансе. Работа с кривой, построенной в другой день, переносит в результат отклонения, связанные с прибором и условиями среды. Распространённой практикой является также многократное измерение каждой концентрации и использование среднего значения.
Фиксируется и то, какой белок использован в качестве стандарта. Обычно выбирают очищенный референсный белок с точно установленной концентрацией. Известно, что референсный белок ведёт себя не совсем так же, как белки образца; поэтому результат читают как эквивалентное значение, выраженное относительно выбранного стандарта.
От кривой к уравнению
Показания наносят на график: по горизонтальной оси — концентрация, по вертикальной — поглощение. Прямую, наилучшим образом проходящую через точки, рассчитывают методом линейной регрессии. Результат — уравнение следующего вида:
y = наклон × x + свободный член
Здесь y — измеренное поглощение, x — искомая концентрация. Концентрацию находят, подставив показание образца в уравнение и решив его относительно x; затем, если было разведение, результат умножают на коэффициент разведения. Отличие свободного члена от нуля — обычное явление, чаще всего связанное с тем, что показание холостой пробы не равно точно нулю.
Повторность измерений — также часть надёжности. Несколько измерений для каждого стандарта и образца не позволяют одной ошибке пипетирования исказить результат. Если расхождение между показаниями больше ожидаемого, этапы подготовки проверяют ещё раз, прежде чем принять кривую.
Что показывает значение R²?
Коэффициент детерминации показывает, насколько хорошо точки ложатся на рассчитанную прямую. Чем ближе он к единице, тем лучше соответствие. В лабораторной практике высокое значение указывает на то, что серия стандартов приготовлена аккуратно, а измерение проведено в линейном диапазоне.
Тем не менее сам по себе этот критерий недостаточен. Высокий коэффициент не исключает, что стандарты приготовлены с неверной концентрацией; он говорит лишь о согласованности точек между собой. Поэтому оценку проводят и по графику кривой: изгиб точек на концах указывает на выход за пределы линейного диапазона.
| Показатель | Значение в протоколе референсной партии |
|---|---|
| Уравнение калибровочной кривой | y = 0,0011x + 0,1726 |
| Коэффициент детерминации | R² = 0,9903 |
| Найденная концентрация белка | 28 mg/mL |
| Место проведения измерения | Независимая лаборатория вне предприятия |
Значения в таблице относятся к одной партии. Для каждой партии измерение проводится заново, и результат может меняться от партии к партии; поэтому протокол следует читать не как неизменную характеристику продукта, а как карточку конкретного образца.
Периодическое обновление кривой — тоже часть надлежащей практики. Работать с давно построенной кривой — значит предполагать, что с того дня ни прибор, ни растворы не изменились. Поэтому условия хранения и сроки годности стандартных растворов также фиксируются в записях.
Типичные ошибки
- Показание вне диапазона: если поглощение образца превышает верхнюю границу кривой, результат ненадёжен; образец разбавляют и повторяют измерение.
- Выбор холостой пробы: холостое измерение должно проводиться с тем же растворителем, что и образец; другой растворитель смещает свободный член.
- Мешающие вещества: компоненты буфера, детергенты и восстановители в зависимости от метода могут влиять на показания.
- Различие референсных белков: результат выражается относительно белка, по которому построена кривая; другой стандарт может дать другое значение.
- Ошибка разведения: при разведении малых объёмов ошибка пипетирования напрямую отражается на результате.
Важно и то, как сообщается результат. Концентрацию обычно указывают в миллиграммах на миллилитр; если требуется общее количество белка, это значение умножают на объём. Помимо числа, протокол содержит метод, использованный референсный белок и условия измерения. Без этих сведений результаты двух лабораторий нельзя сравнивать напрямую.
Где используется результат?
Концентрация белка — не просто число, а входные данные для последующих анализов. От неё зависит, сколько образца наносить на гель при электрофорезе; подробности метода изложены в статье о SDS-PAGE. Физическая основа измерения поглощения рассмотрена в статье об UV-Vis.
Это значение входит и в карточку партии и указывается в сертификате анализа вместе с методом; как читать сертификат, рассказано в статье о CoA. Особый вес при оценке результата имеет и то, что измерение проведено вне предприятия, в независимой лаборатории. Результаты по нашим партиям публикуются на странице анализа.
