Один из самых быстрых способов понять, что находится в растворе, — направить на него свет и посмотреть, сколько его пройдёт. UV-Vis-спектрофотометрия выражает эту простую идею в числах: свет ультрафиолетовой и видимой области пропускают через образец и сравнивают интенсивность на входе и на выходе.
Основные узлы прибора — источник света, устройство выбора длины волны, кювета с образцом и детектор, измеряющий прошедший свет. Перед измерением необходимо измерить один растворитель, то есть снять холостое показание; тогда полученное значение отражает только вклад растворённого вещества.
Выбор кюветы тоже напрямую влияет на результат. Обычные пластиковые и стеклянные кюветы сами поглощают в ультрафиолетовой области и искажают показание при 280 нанометрах; в этой области используют кварцевые кюветы. Чистые окна кюветы, отсутствие пузырьков воздуха в растворе и свободный оптический путь — основные условия измерения.
От чего зависит поглощение?
Поглощение изменяется в зависимости от трёх факторов: способности вещества поглощать на данной длине волны, концентрации в растворе и длины пути, который свет проходит в образце. Линейная зависимость между ними — основа спектрофотометрического измерения; длина оптического пути в стандартных кюветах постоянна.
У линейности есть рабочий диапазон. В очень концентрированных растворах до детектора доходит слишком мало света, и измерение теряет надёжность; в очень разбавленных сигнал теряется в шуме. Поэтому образец разводят так, чтобы попасть в надёжный диапазон прибора, и учитывают коэффициент разведения.
Сам прибор тоже готовят к измерению. Лампа должна прогреться, базовая линия — быть ровной, а точность установки длины волны — регулярно проверяться. Если базовая линия дрейфует, показание несёт вклад не образца, а прибора.
Почему 280 нанометров?
Три аминокислоты, входящие в белковые и пептидные цепи, заметно поглощают в ультрафиолетовой области: триптофан, тирозин и, слабее, фенилаланин. Кольцевая структура этих остатков даёт максимум поглощения около 280 нанометров. Поэтому значение, измеренное в растворе на этой длине волны, служит практическим показателем присутствия белка.
Вторая причина выбора — селективность. Сама пептидная связь очень сильно поглощает около 200 нанометров, но в этой области поглощают и буферы, и растворители, поэтому измерение сопровождается сильным шумом. 280 нанометров — компромисс, при котором сигнал белка хорошо читается, а вклад среды остаётся относительно низким.
| Длина волны | Поглощающая структура | Практическое замечание |
|---|---|---|
| ~200 nm | Пептидная связь | Очень чувствительно, но велик вклад растворителя и буфера |
| ~260 nm | Нуклеиновые кислоты | Отслеживается как показатель загрязнения образца нуклеиновыми кислотами |
| ~280 nm | Триптофан и тирозин | Обычный выбор для измерения белка |
| 320 nm и выше | Заметного поглощения не ожидается | Подъём считается признаком мутности или агрегации |
Одновременное измерение на второй длине волны усиливает интерпретацию. Нуклеиновые кислоты сильно поглощают около 260 нанометров; отношение двух значений позволяет судить, есть ли в образце вклад нуклеиновых кислот. Для материала с преобладанием пептидов, такого как яд, это отношение можно отслеживать как вспомогательный критерий чистоты пробоподготовки.
Что показывает спектр сканирования?
Если вместо измерения на одной длине волны просканировать широкий диапазон, результат получается в виде кривой. Её форма говорит больше, чем одно число: видно, где именно находится максимум, насколько ровна область вне пика и нет ли подъёма в сторону длинных волн. Неожиданный подъём в длинноволновой области обычно указывает на нерастворённые частицы или агрегацию.
При сканировании референсной партии нашего предприятия был измерен диапазон от 190 до 400 нанометров, а максимум зарегистрирован при 280 нанометрах. Измерение выполнено на спектрофотометре Shimadzu UV-1900i в независимой лаборатории вне предприятия. Результат согласуется с тем, что образец состоит из компонентов, содержащих ароматические аминокислоты.
Для воспроизводимости измерения фиксируют и то, как подготовлен образец: растворитель, коэффициент разведения, время растворения и температуру измерения. При измерении одного и того же образца в разных разведениях значения должны согласовываться с коэффициентом разведения; несоответствие чаще всего указывает на неполное растворение или агрегацию, и измерение повторяют.
В отличие от большинства методов, сканирование не расходует образец. Раствор из кюветы после измерения можно забрать и продолжить на том же образце другие анализы. Для материала, количество которого ограничено, это практическое преимущество, ставящее метод в начало последовательности анализов.
По той же причине спектрофотометрическое измерение используют и как первый шаг контроля при приёмке партии. Если ожидаемый пик не на своём месте или форма кривой необычна, пробоподготовку проверяют ещё раз, прежде чем переходить к следующим анализам.
Чего метод не говорит?
Значение при 280 нанометрах быстро говорит о присутствии белка, но не даёт сведений об идентичности. Какие белки присутствуют, на сколько компонентов они распределены или какова их молекулярная масса — из этого измерения установить невозможно. Кроме того, пептид с низким содержанием ароматических остатков может дать более слабый сигнал, чем ожидается при его реальном количестве.
Поэтому спектрофотометрию используют не изолированно, а как первое звено цепочки анализов. Число компонентов определяют разделением методом хроматографии; подробности — в статье о ВЭЖХ (HPLC). Для распределения масс применяют электрофорез. Численное значение концентрации требует калибровки; построение калибровочной кривой рассматривается в статье об определении белка.
Главное достоинство метода — скорость: за несколько минут и без расходования образца он даёт первичную оценку. Результаты измерений по нашим партиям публикуются на странице анализа; для каждой партии значения измеряются заново.
