من أسرع سبل معرفة ما في محلول ما أن يُرسَل إليه ضوء ويُنظر كم منه يعود. ومطيافية UV-Vis تحوّل هذه الفكرة البسيطة إلى قياس رقمي: يُمرَّر الضوء في المنطقتين فوق البنفسجية والمرئية عبر العيّنة، ثم تُقارَن شدة الداخل بشدة الخارج.
والأجزاء الأساسية للجهاز مصدرُ ضوء، ومنظومةٌ تختار طول الموجة، وخليةُ قياس تحمل العيّنة، وكاشفٌ يقيس الضوء الخارج. ويلزم قبل القياس قراءةُ المذيب وحده، أي أخذ قياس الشاهد؛ وبذلك تعكس القيمة الناتجة إسهام المادة المذابة وحدها.
واختيار خلية القياس يؤثر في النتيجة مباشرة. فخلايا البلاستيك والزجاج العادية تمتص هي نفسها في المنطقة فوق البنفسجية فتفسد القراءة عند 280 نانومترًا؛ ولهذا تُستخدم في هذه المنطقة خلايا من الكوارتز. ونظافةُ نوافذ الخلية، وخلوُّ المحلول من فقاعات الهواء، وعدمُ اعتراض مسار الضوء شروطٌ أساسية للقياس.
بماذا يرتبط الامتصاص؟
يتغير الامتصاص مع ثلاثة عوامل معًا: قابلية المادة للامتصاص عند طول الموجة المعني، والتركيز في المحلول، وطول المسار الذي يقطعه الضوء داخل العيّنة. والعلاقة الخطية بين هذه الثلاثة هي أساس القياس الطيفي الضوئي، ويبقى طول المسار ثابتًا في خلايا القياس القياسية.
وللخطية مجال عمل. ففي المحاليل شديدة التركيز يقلّ الضوء الواصل إلى الكاشف قلةً مفرطة فيفقد القياس موثوقيته؛ وفي المحاليل شديدة التخفيف تضيع الإشارة داخل الضجيج. ولهذا تُخفَّف العيّنة حتى تقع في المجال الآمن للجهاز، ويُؤخذ معامل التخفيف في الحسبان.
ويُهيَّأ الجهاز نفسه أيضًا قبل القياس. فيُتوقع أن يسخن المصباح، وأن يكون خط الأساس مستويًا، وأن تُراجَع دقة طول الموجة على فترات منتظمة. وإذا كان في خط الأساس انزياح، فمعنى ذلك أن القيمة المقروءة تحمل إسهامًا آتيًا من الجهاز لا من العيّنة.
لماذا 280 نانومترًا؟
تُبدي ثلاثة أحماض أمينية موجودة في سلاسل البروتينات والببتيدات امتصاصًا واضحًا في المنطقة فوق البنفسجية: التريبتوفان والتيروسين، وبدرجة أضعف الفينيل ألانين. وتنتج البنية الحلقية في هذه البقايا قمة امتصاص عند 280 نانومترًا تقريبًا. ولهذا تكون القيمة المقروءة عند هذا الطول الموجي في محلول ما مؤشرًا عمليًا على وجود بروتين.
والسبب الثاني للاختيار هو الانتقائية. فالرابطة الببتيدية نفسها تمتص امتصاصًا قويًا جدًا عند 200 نانومتر تقريبًا، غير أن المحاليل المنظِّمة والمذيبات تمتص في هذه المنطقة أيضًا فيصير القياس مشوبًا بالضجيج. و280 نانومترًا نقطةُ توفيق تُقرأ عندها إشارة البروتين ويبقى إسهام الوسط منخفضًا نسبيًا.
| طول الموجة | البنية الماصة | ملاحظة عملية |
|---|---|---|
| ~200 nm | الرابطة الببتيدية | حساسة جدًا، لكن إسهام المذيب والمحلول المنظِّم مرتفع |
| ~260 nm | الأحماض النووية | يُرصد بوصفه مؤشرًا على تلوّث العيّنة بالأحماض النووية |
| ~280 nm | التريبتوفان والتيروسين | الخيار الشائع في قياس البروتين |
| 320 nm وما فوقها | لا يُتوقع امتصاص ملحوظ | يُعدّ الارتفاع علامة على العكارة أو التكتل |
وقراءةُ طول موجة ثانٍ معه تعزز التفسير. فالأحماض النووية تمتص بقوة عند 260 نانومترًا تقريبًا؛ ونسبةُ القيمتين تعطي فكرة عمّا إذا كان في العيّنة إسهام مصدره الأحماض النووية. وفي مادة غالبها ببتيدات مثل السم يمكن رصد هذه النسبة بوصفها معيارًا مساعدًا يدل على نظافة تحضير العيّنة.
ماذا يقول منحنى المسح؟
وإذا مُسِح مجال واسع بدل القراءة عند طول موجة واحد، جاءت النتيجة على هيئة منحنى. وشكلُ هذا المنحنى يقول أكثر مما يقوله رقم واحد: إذ يظهر فيه موضع القمة بالضبط، وانتظام المنطقة خارج القمة، ووجودُ ارتفاع نحو الأطوال الموجية الطويلة من عدمه. والارتفاع غير المتوقع عند الأطوال الطويلة يشير عادةً إلى جسيمات غير ذائبة أو إلى تكتل.
وفي المسح الذي أُجري للدفعة المرجعية في منشأتنا قُرئ المجال من 190 إلى 400 نانومتر، وسُجّلت القمة العظمى عند 280 نانومترًا. وأُجري القياس بمطياف Shimadzu UV-1900i في مختبر مستقل خارج المنشأة. والنتيجة متوافقة مع كون العيّنة مؤلفة من مكوّنات تحتوي أحماضًا أمينية عطرية.
ويُسجَّل أيضًا كيف حُضِّرت العيّنة حتى يكون القياس قابلًا للتكرار: المذيب، ومعامل التخفيف، وزمن الذوبان، ودرجة حرارة القياس. وعند قراءة العيّنة نفسها بتخفيفات مختلفة يُتوقع أن تأتي القيم متوافقة مع معامل التخفيف؛ وعدمُ التوافق يشير في الغالب إلى ذوبان ناقص أو إلى تكتل، فيُعاد القياس.
والمسح، بخلاف معظم الطرائق، لا يستهلك العيّنة. فيمكن استرجاع المحلول من خلية القياس بعد القياس ومتابعة تحاليل أخرى على العيّنة نفسها. وفي مادة محدودة الكمية يمثّل ذلك ميزة عملية تضع الطريقة في مقدمة ترتيب التحاليل.
وللسبب نفسه تُستخدم القراءة الطيفية خطوةَ تحقّق أولى عند قبول دفعة ما. فإذا لم تكن القمة المتوقعة في موضعها أو كان شكل المنحنى غير مألوف، رُوجع تحضير العيّنة قبل الانتقال إلى التحاليل التالية.
ما الذي لا تقوله الطريقة؟
والقيمة عند 280 نانومترًا تعطي معلومة سريعة عن وجود بروتين، لكنها لا تعطي معلومة عن الهوية. فلا يمكن أن يُستخلص من هذا القياس ما البروتينات الموجودة، ولا على كم مكوّن تتوزع، ولا أوزانها الجزيئية. كما أن ببتيدًا قليل المحتوى من البقايا العطرية قد يعطي إشارة أضعف مما يُتوقع بالنظر إلى كميته الحقيقية.
ولهذا لا يُستخدم القياس الطيفي الضوئي وحده، بل بوصفه الحلقة الأولى في سلسلة تحليلية. فعددُ المكوّنات يُحدَّد بالفصل الكروماتوغرافي؛ والتفصيل في مقال HPLC. ويُستخدم لتوزيع الأوزان الرحلان الكهربائي. أما التركيز الرقمي فيتطلب معايرة؛ ويُتناول إنشاء المنحنى المعياري في مقال تعيين البروتين.
وأقوى ما في الطريقة سرعتُها: فهي تتيح تقييمًا أوليًا في دقائق معدودة دون استهلاك العيّنة. وتُنشَر نتائج قياساتنا على مستوى الدفعة في صفحة التحليل؛ وتُقاس القيم من جديد لكل دفعة.
