الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء، واختصارًا HPLC، طريقة تحليلية تُستخدم لفصل مكوّنات خليط بعضها عن بعض وإظهار كل مكوّن مفصول على حدة. وهي الطريقة الأكثر شيوعًا لاستخراج الملف في عيّنات تحمل عشرات المكوّنات مثل السم.
تدين الطريقة بعبارة «الأداء العالي» في اسمها إلى مادة الحشو الدقيقة الحبيبات. فكلما صغرت الحبيبات ازداد الفصل حدّة، لكن تزداد كذلك مقاومة التدفق؛ وللتغلب على هذه المقاومة تلزم مضخات تعمل بضغط عالٍ. وفي المنظومات الحديثة تُضبط المضخة ووحدة الحقن وفرن العمود والكاشف معًا على خط تدفق واحد، ويسجّل البرنامج جميع الظروف.
مبدأ العمل
قلب المنظومة عمودٌ محشوّ بإحكام بمادة الحشو. وتمرّر المضخة المذيبَ المسمّى الطور المتحرك عبر هذا العمود بضغط عالٍ. وعند حقن العيّنة في التدفق يتفاعل كل مكوّن بقوة مختلفة مع مادة الحشو (الطور الثابت) ومع المذيب. فالمكوّن الأشد التصاقًا بالطور الثابت يبقى في العمود مدة أطول، والأقل التصاقًا يخرج أولًا. ويقيس الكاشف عند مخرج العمود المادةَ العابرة فيرسم إشارة مقابل الزمن؛ ويُسمى هذا الرسم الكروماتوغرام.
وثبات درجة حرارة العمود مهم لقابلية التكرار؛ فعند تغيّر الحرارة يتغير سلوك التصاق المكوّنات وتنزاح القمم. وللسبب نفسه يُنتظر أن يتوازن العمود عند الظروف الابتدائية قبل كل تشغيل. وكتابةُ طراز الجهاز ونوع العمود وظروف البرنامج في التقارير إنما تكون لإتاحة تكرار النتيجة في مختبر آخر. وفي تحليل الدفعة المرجعية أُجري الفصل بمنظومة Shimadzu Prominence-i LC2030 3D.
ماذا يعني الطور المعكوس؟
في الكروماتوغرافيا التقليدية ذات الطور المستقيم يكون الطور الثابت قطبيًا والطور المتحرك غير قطبي. وفي الطور المعكوس (RP-HPLC) تنعكس هذه العلاقة: إذ يُجعل الطور الثابت غير قطبي بسلاسل هيدروكربونية طويلة مرتبطة بسطح السيليكا، ويكون الطور المتحرك مائيًا وقطبيًا. وبذلك يجري الفصل وفق كراهية الجزيئات للماء. ولأن الببتيدات تحمل سطوحًا محبّة للماء وأخرى كارهة له، صار هذا النهج معيارًا في تحليل الببتيدات.
وفي التطبيق لا يُترك الطور المتحرك بتركيب واحد. ففي البداية يغلب عليه الماء، ثم تُزاد نسبة المذيب العضوي تدريجيًا مع الوقت. وفي هذه الطريقة المسماة الإرواء المتدرج تخرج المكوّنات المحبّة للماء مبكرًا والكارهة له متأخرًا، فيُمسح نطاق قطبية واسع في تشغيل واحد. وفي تحليل الدفعة المرجعية طُبِّق تدرج منخفض مع عمود الطور المعكوس، ورُفعت نسبة المذيب العضوي من صفر إلى ستين بالمئة.
لماذا يكون الكشف عند 280 nm؟
تمتص البروتينات والببتيدات الضوء عند نحو 280 نانومتر بسبب بقايا التربتوفان والتيروزين في بنيتها. والقراءة عند هذا الطول الموجي تحدّ من الضجيج الآتي من مكوّنات المحلول المنظِّم، وتُظهر في الوقت نفسه القمم المحتوية على بروتين إظهارًا انتقائيًا. وقد بُحثت فيزياء الامتصاص في مقالة القياس عند 280 nm.
خطوات التشغيل الواحد
- تُوزن العيّنة وتُحضَّر بتركيز محدَّد في مذيب مناسب؛ وفي تحليل الدفعة المرجعية أُذيبت العيّنة بتركيز 1000 ppm.
- يُرشَّح المحلول لإزالة الجسيمات؛ ولا تُتجاوز هذه الخطوة كي لا ينسدّ العمود.
- يُوازَن العمود عند الظروف الابتدائية.
- تُحقن العيّنة ويُبدَأ برنامج التدرج.
- تُسجَّل إشارة الكاشف، وتُقيَّم القمم من حيث زمن الاحتجاز والمساحة.
- وعند الحاجة تُجمع القمم كلٌّ على حدة وتُنقل إلى التحاليل اللاحقة.
وتحضير العيّنة مصدر الجزء الأكبر من المشكلات. فالحبيبات التي تبقى دون ذوبان تسدّ مدخل العمود، والمذيب غير المناسب يُفسد شكل القمة. ولذلك تُحضَّر العيّنة في مذيب قريب من التركيب الابتدائي للطور المتحرك وتُرشَّح قبل الحقن. كما أن إبقاء حجم الحقن معقولًا بالنسبة إلى العمود يمنع اتساع القمم.
ماذا يقول الكروماتوغرام؟
| المعيار | المعنى |
|---|---|
| زمن الاحتجاز | اللحظة التي يخرج فيها المكوّن من العمود؛ وهي هوية قابلة للتكرار في الظروف نفسها |
| مساحة القمة | ترتبط بالكمية النسبية للمكوّن |
| عدد القمم | يدل على عدد المكوّنات القابلة للفصل |
| عرض القمة | يعطي معلومات عن كفاءة الفصل وحالة العمود |
| خط الأساس | انزياحه يشير إلى مشكلات مصدرها المنظومة أو التدرج |
في تحليل الدفعة المرجعية فُصل 37 بروتينًا وببتيدًا عند 280 nm. وينبغي ألا يغيب أن هذا العدد مرهون بالظروف: فعند تغيّر نوع العمود أو ميل التدرج أو الطول الموجي للكشف يمكن الحصول على عدد مختلف من القمم من العيّنة نفسها. ويُشرح تفصيل قراءة الكروماتوغرام في مقالة الكروماتوغرام.
وكثيرًا ما تُقيَّم مساحات القمم تقييمًا نسبيًا. ولإعطاء كمية مكوّن ما إعطاءً مطلقًا يلزم إجراء معايرة بمحاليل من المكوّن نفسه محضَّرة بتراكيز معلومة. ولعدم توفر معيار نقي لمعظم مكوّنات السم، يُستخدم الملف بوصفه بصمة مقارِنة أكثر منه قياسًا كميًا.
ولا يُكتفى بمتابعة القمم المفصولة، بل يمكن جمعها أيضًا. فعندما يُؤخذ التدفق عند مخرج العمود في أوعية منفصلة بحسب الزمن، يُحصَل على كل قمة في جزء خاص بها. ويمكن تجفيف هذه الأجزاء بالتجميد وحفظها والعمل عليها في التحاليل اللاحقة كأنها مكوّن مفرد. وعزل ببتيد مثير للاهتمام من خليط معقد يبدأ غالبًا بهذه الطريقة. وإذا لم يُسجَّل من أي تشغيل ومن أي فاصل زمني جاء الجزء المجموع، ضاعت هوية الجزء؛ ولذلك تُكتب خطة الجمع قبل التحليل.
حدود الطريقة
تفصل HPLC المكوّنات لكنها لا تحدد هوياتها وحدها. فلمعرفة أي ببتيد تقابله قمة ما يلزم الوزن الجزيئي ومعلومات التسلسل؛ ولذلك تُستخدم الكروماتوغرافيا غالبًا مع طرق مثل SDS-PAGE ومطيافية الكتلة. وقد لُخِّص سير التحليل لدينا كاملًا في صفحة التحليل.
