كيف يُقرأ الكروماتوغرام؟ القمة وزمن الاحتجاز والمساحة

الكروماتوغرام هو الرسم البياني الذي يُحصَل عليه في نهاية عملية فصل كروماتوغرافي، ويعرض إشارة الكاشف مقابل الزمن. وهو يشبه في النظرة الأولى سلسلة من ظلال الجبال. أما إذا قُرئ قراءة صحيحة فإنه يخبر بعدد المكوّنات التي فُصلت في العيّنة، وبنسبها بعضها إلى بعض، وبمدى موثوقية الفصل. وقد شُرح مبدأ عمل الطريقة في مقال HPLC؛ وتركّز هذه المقالة على كيفية تفسير الرسم الناتج.

المحاور والمفاهيم الأساسية

يعرض المحور الأفقي الزمن، بالدقائق عادةً. والمحور الرأسي هو استجابة الكاشف؛ وفي الكواشف فوق البنفسجية يُعبَّر عن هذه الاستجابة بوحدة الامتصاص أو بجزء من ألف منها، أي وحدة الامتصاص الملّي (mAU). ولحظةُ إدخال العيّنة إلى العمود هي نقطة الصفر في الرسم.

ويُسمّى الزمنُ الذي يستغرقه جزيء لا يتفاعل مع العمود إطلاقًا حتى يبلغ الكاشف بالزمن الميت. والتموّج الصغير الذي يُرى في بداية الرسم يشير في الغالب إلى هذه اللحظة. ولا يمكن لأي مكوّن أن يخرج قبل الزمن الميت؛ أما القمم التي تليه مباشرة فهي مكوّنات محبّة للماء لم تلتصق بالعمود تقريبًا.

وكثير من البرامج يرسم برنامج التدرج أيضًا خطًا ثانيًا فوق الكروماتوغرام. ورؤيةُ نسبة المذيب العضوي التي خرجت عندها قمةٌ ما تعطي فكرة مباشرة عن كراهية المكوّن للماء. غير أن التركيب الذي تضبطه المضخة يصل إلى العمود بشيء من التأخير بسبب حجم الخطوط والخلّاط في المنظومة؛ ويُؤخذ هذا التأخير في الحسبان عند مقارنة كروماتوغرامَي جهازين مختلفين.

المفهوم	كيف يُقرأ؟	علامَ يدلّ؟
زمن الاحتجاز	الزمن المنقضي من الحقن حتى أعلى نقطة في القمة	قرينة هوية قابلة للتكرار في الظروف نفسها
عامل الاحتجاز	نسبة الفرق بين زمن الاحتجاز والزمن الميت إلى الزمن الميت	مقدار التصاق المكوّن بالعمود
مساحة القمة	المساحة الواقعة تحت منحنى القمة	إشارة تتناسب مع كمية المادة التي تبلغ الكاشف
ارتفاع القمة	المسافة من خط الأساس إلى ذروة القمة	تقدير سريع؛ وأقل موثوقية في القمم العريضة
الذوبانية	نسبة الفرق الزمني بين قمتين متجاورتين إلى متوسط عرضيهما	مدى انفصال المكوّنين أحدهما عن الآخر
التماثل	مقارنة النصف الأمامي للقمة بنصفها الخلفي	التذييل أو الاتساع من الأمام

القمة والمساحة والارتفاع

تشبه القمة المثالية منحنى جرس متماثلًا. ومساحة القمة مرتبطة بكمية المادة العابرة من الكاشف، وهي المقدار المعتمَد في التقييم الكمّي. ويحمل الارتفاع معلومة مماثلة، غير أن الكمية نفسها تعطي قمة أكثر انبساطًا كلما اتسعت القمة؛ ولهذا يُنظر إلى الارتفاع بوصفه اختصارًا نافعًا في القمم الضيقة المنتظمة.

ويُسمّى حساب المساحة بالتكامل، ويقوم به البرنامج. فالبرنامج يقرر ببارامتراته الخاصة أين يبدأ خط الأساس وأين ينتهي، وأين تقع حدود القمة؛ وعند تغيّر البارامترات قد تخرج قيم مساحة مختلفة من الكروماتوغرام نفسه. ورسمُ خط عمودي بين قمتين ملتصقتين، أو فصلُ القمة الصغيرة عن سفح القمة الكبيرة بمماس، خياران شائعان يغيّران النتيجة. وذكرُ التصحيحات اليدوية في التقرير جزء من الممارسة الجيدة.

لماذا لا تكون النسبة المئوية للمساحة نسبةً مئوية كتلية؟

النسبة المئوية للمساحة التي تتكرر رؤيتها في التقارير هي نسبة مساحة كل قمة إلى المساحة الكلية. ولا ينبغي أن تُقرأ هذه القيمة كنسبة كتلية للمكوّنات، لأن استجابة الكاشف تختلف من مكوّن إلى آخر. فعند القياس عند 280 نانومتر يعطي ببتيد غني بالتربتوفان والتيروزين إشارة قوية، ويبدو الببتيد القليل هذه البقايا ضعيفًا، أما الخالي منها فلا يكاد يظهر. وقد شُرحت خلفية اختيار الطول الموجي في مقال 280 nm. وللكمية المطلقة يلزم إجراء معايرة بمعيار نقي للمكوّن المعني.

جودة الفصل

إذا هبطت الإشارة بين قمتين متجاورتين حتى خط الأساس فهذا يعني أن المكوّنين قد انفصلا انفصالًا تامًّا. ويُعدّ ذلك متحققًا عادةً حين تبلغ قيمة دقة الفصل نحو 1.5 فما فوق. وفي القيم الأدنى تتراكب القمم ويؤثر بعضُ المساحات في بعض.

والتماثل أيضًا يعطي معلومة عن سلامة الفصل. فالقمم التي يمتد جانبها الخلفي وتُذيَّل تشير في الغالب إلى تفاعلات ثانوية غير مرغوبة بين المكوّن وسطح العمود، أو إلى تآكل العمود. أما القمم المتسعة من الأمام فتُربط بتحميل العمود تحميلًا مفرطًا، أو بتحضير العيّنة في مذيب غير مناسب. والكتف الذي يُرى على منحدر قمةٍ ما هو في أغلب الأحيان أثرُ مكوّن ثانٍ لم ينفصل.

وفي المنظومات المزوّدة بكاشف مصفوفة الثنائيات، يمكن الحصول على فكرة إضافية عمّا إذا كانت القمة مكوَّنة من مادة واحدة، وذلك بمقارنة الأطياف المأخوذة من أول القمة إلى آخرها. وهذا الفحص قرينة نافعة، لكنه قد يقصر عن التمييز بين ببتيدات تتشابه أطيافها تشابهًا شديدًا.

القراءة خطوة بخطوة

1. اقرأ عنوان الطريقة: العمود، وبرنامج التدرج، والطول الموجي، وحجم الحقن.
2. افحص التشغيل الفارغ: القمم التي تظهر في تدرج يُشغَّل بلا عيّنة تأتي من المذيب أو من المنظومة، ولا تُنسب إلى العيّنة.
3. حدّد الزمن الميت واستبعد الإشارة السابقة له من التقييم.
4. تابع خط الأساس: الانزياح الطفيف على امتداد التدرج أمر معتاد، أما القفزات المفاجئة فلا.
5. عُدّ القمم؛ ولا تَعُدّ قمةً تموّجاتٍ لا تتجاوز مستوى الضجيج تجاوزًا واضحًا.
6. انظر في فصل القمم المتجاورة، وفي التماثل، وفي الأكتاف.
7. قيّم جدول المساحات مع بارامترات التكامل.
8. قارن الرسم بتراكبه مع كروماتوغرام مرجعي أُجري بالطريقة نفسها.

ومن القواعد الشائعة لعتبة الضجيج أن يُعدّ المستوى الذي تتجاوز فيه الإشارة الضجيج بنحو ثلاثة أضعاف حدَّ الكشف، والمستوى الذي تتجاوزه بعشرة أضعاف حدَّ القياس الكمّي الموثوق.

القراءة في ملف السم

في عيّنة سم تحوي عشرات المكوّنات، يُقرأ الكروماتوغرام ككل بوصفه بصمة، أكثر مما يُقرأ قمةً قمة. وفي تحليل دفعتنا المرجعية أُجري الفصل بالطور المعكوس بتدرج تصاعدي لنسبة المذيب العضوي من صفر إلى ستين بالمئة، وفُصل 37 بروتينًا وببتيدًا عند 280 نانومتر. وعند مقارنة دفعتين تُقارَن أزمنةُ احتجاز القمم الرئيسية ومساحاتها بعضها إلى بعض، أكثر من عدد القمم؛ أما الانزياحات الصغيرة في قمة مفردة فتبقى في الغالب ضمن حدود تغيّرية الطريقة.

الكروماتوغرام يفصل المكوّنات، لكنه لا يسمّيها. ويُحدَّد الببتيد الذي تقابله قمةٌ ما بطرق مكمِّلة مثل مطيافية الكتلة. وتُنشَر نتائج دفعاتنا وظروف الطريقة في صفحة التحليل.