Kromatogram, bir kromatografi çalışmasının sonunda elde edilen ve dedektör sinyalini zamana karşı gösteren grafiktir. İlk bakışta bir dizi dağ silüetine benzer. Doğru okunduğunda ise numunede kaç bileşenin ayrıldığını, bunların birbirine göre oranlarını ve ayrımın ne kadar güvenilir olduğunu anlatır. Yöntemin çalışma ilkesi HPLC yazısında anlatıldı; bu yazı ortaya çıkan grafiğin nasıl yorumlandığına odaklanıyor.
Eksenler ve temel kavramlar
Yatay eksen zamanı, genellikle dakika cinsinden gösterir. Dikey eksen dedektörün cevabıdır; ultraviyole dedektörlerde bu cevap soğurma birimi ya da onun binde biri olan mili soğurma birimi (mAU) ile ifade edilir. Numunenin kolona verildiği an grafiğin sıfır noktasıdır.
Kolonla hiç etkileşmeyen bir molekülün dedektöre ulaşma süresine ölü zaman denir. Grafiğin başında görülen küçük dalgalanma çoğunlukla bu anı işaret eder. Ölü zamandan önce hiçbir bileşen çıkamaz; hemen ardından gelen tepeler ise kolonda neredeyse hiç tutunmamış, suyu seven bileşenlerdir.
Birçok yazılım gradyan programını da kromatogramın üzerine ikinci bir çizgi olarak çizer. Bir tepenin hangi organik çözücü oranında çıktığını görmek, bileşenin hidrofobikliği hakkında doğrudan fikir verir. Yalnız pompanın ayarladığı bileşim, sistemdeki hat ve karıştırıcı hacmi nedeniyle kolona bir miktar gecikmeyle ulaşır; iki farklı cihazın kromatogramları karşılaştırılırken bu gecikme hesaba katılır.
| Kavram | Nasıl okunur? | Ne anlatır? |
|---|---|---|
| Alıkonma süresi | Enjeksiyondan tepenin en yüksek noktasına kadar geçen süre | Aynı koşullarda tekrarlanabilir bir kimlik ipucu |
| Alıkonma faktörü | Alıkonma süresi ile ölü zaman arasındaki farkın ölü zamana oranı | Bileşenin kolonda ne kadar tutunduğu |
| Tepe alanı | Tepe eğrisinin altında kalan yüzey | Dedektöre ulaşan madde miktarıyla orantılı sinyal |
| Tepe yüksekliği | Taban çizgisinden tepe noktasına mesafe | Hızlı tahmin; geniş tepelerde daha az güvenilir |
| Çözünürlük | Komşu iki tepenin süre farkının, genişliklerinin ortalamasına oranı | İki bileşenin birbirinden ne kadar ayrıldığı |
| Simetri | Tepenin ön ve arka yarısının karşılaştırılması | Kuyruklanma ya da önden yayılma |
Tepe, alan ve yükseklik
İdeal bir tepe simetrik bir çan eğrisine benzer. Tepenin alanı dedektörden geçen madde miktarıyla ilişkilidir ve nicel değerlendirmede esas alınan büyüklüktür. Yükseklik de benzer bilgi taşır, ancak tepe genişledikçe aynı miktar madde daha basık bir tepe verir; bu yüzden yükseklik, dar ve düzgün tepelerde işe yarayan bir kısayol olarak görülür.
Alanın hesaplanmasına entegrasyon denir ve yazılım tarafından yapılır. Yazılım, taban çizgisinin nerede başlayıp bittiğine ve tepenin sınırlarına kendi parametreleriyle karar verir; parametreler değiştiğinde aynı kromatogramdan farklı alan değerleri çıkabilir. Birbirine yapışık tepelerin arasına dik bir çizgi çekmek ya da küçük tepeyi büyük tepenin eteğinden teğetle ayırmak, sonucu farklılaştıran iki yaygın tercihtir. Elle yapılan düzeltmelerin raporda belirtilmesi iyi uygulamanın parçasıdır.
Alan yüzdesi neden kütle yüzdesi değildir?
Raporlarda sık görülen alan yüzdesi, her tepenin alanının toplam alana oranıdır. Bu değer bileşenlerin kütlece oranı gibi okunmamalıdır, çünkü dedektörün her bileşene verdiği cevap farklıdır. 280 nanometrede ölçüm yapıldığında triptofan ve tirozin bakımından zengin bir peptid güçlü sinyal verir, bu kalıntıları az taşıyan bir peptid zayıf görünür, hiç taşımayan bir peptid ise neredeyse hiç görünmez. Dalga boyu seçiminin arka planı 280 nm yazısında açıklandı. Mutlak miktar için ilgili bileşenin saf standardıyla kalibrasyon gerekir.
Ayrımın kalitesi
İki komşu tepenin arasındaki sinyal taban çizgisine kadar iniyorsa bileşenler tam ayrılmış demektir. Çözünürlük değeri yaklaşık 1,5 ve üzerine çıktığında bu durum genellikle sağlanmış kabul edilir. Daha düşük değerlerde tepeler üst üste biner ve alanlar birbirini etkiler.
Simetri de ayrımın sağlığı hakkında bilgi verir. Arka tarafı uzayan, kuyruklanan tepeler çoğunlukla bileşenin kolon yüzeyiyle istenmeyen ikincil etkileşimlerine ya da kolonun yıpranmasına işaret eder. Önden yayılan tepeler ise kolonun aşırı yüklenmesiyle ya da numunenin uygun olmayan bir çözücüde hazırlanmasıyla ilişkilendirilir. Bir tepenin yamacında görülen omuz, çoğu zaman ayrılamamış ikinci bir bileşenin izidir.
Diyot dizisi dedektörü bulunan sistemlerde, bir tepenin başından sonuna alınan spektrumlar karşılaştırılarak tepenin tek bir bileşenden oluşup oluşmadığı hakkında ek fikir edinilebilir. Bu kontrol yararlı bir ipucudur, ancak spektrumları birbirine çok benzeyen peptidleri ayırt etmekte yetersiz kalabilir.
Adım adım okuma
- Yöntem başlığını okuyun: kolon, gradyan programı, dalga boyu ve enjeksiyon miktarı.
- Boş çalışmayı inceleyin: numunesiz çalıştırılan gradyanda görülen tepeler çözücüden ya da sistemden gelir ve numuneye atfedilmez.
- Ölü zamanı belirleyin ve ondan önceki sinyali değerlendirme dışında tutun.
- Taban çizgisini izleyin: gradyan boyunca hafif kayma olağandır, ani sıçramalar değildir.
- Tepeleri sayın; gürültü düzeyini belirgin biçimde aşmayan dalgalanmaları tepe saymayın.
- Komşu tepelerin ayrımına, simetriye ve omuzlara bakın.
- Alan tablosunu entegrasyon parametreleriyle birlikte değerlendirin.
- Aynı yöntemle çalışılmış bir referans kromatogramla üst üste karşılaştırın.
Gürültü eşiği için yaygın bir kural, sinyalin gürültünün yaklaşık üç katını aştığı düzeyi tespit sınırı, on katını aştığı düzeyi ise güvenilir nicel ölçüm sınırı saymaktır.
Venom profilinde okuma
Onlarca bileşen içeren bir venom numunesinde kromatogram, tek tek tepelerden çok bütün olarak bir parmak izi gibi okunur. Referans parti analizimizde ters faz ayrımı, organik çözücü oranı yüzde sıfırdan altmışa çıkan bir gradyanla yapılmış ve 280 nanometrede 37 protein ve peptid çözünürlenmiştir. İki parti karşılaştırılırken tepe sayısından çok ana tepelerin alıkonma süreleri ve birbirlerine göre alanları kıyaslanır; tekil bir tepedeki küçük kaymalar çoğu zaman yöntem değişkenliğinin sınırları içinde kalır.
Kromatogram bileşenleri ayırır, ancak onlara ad vermez. Bir tepenin hangi peptide karşılık geldiği kütle spektrometrisi gibi tamamlayıcı yöntemlerle belirlenir. Parti sonuçlarımız ve yöntem koşulları analiz sayfasında yayımlanır.
