Kromatografi bir venomu bileşenlerine ayırır, ancak ayrılan tepelerin ne olduğunu söylemez. Bir bileşenin kimliğini belirlemek için kütlesini ve mümkünse aminoasit dizisini bilmek gerekir. Kütle spektrometrisi bu iki bilgiyi birlikte verebilen yöntemdir ve venom araştırmalarında peptid tanımlamanın temel araçlarından biridir.
Yöntemin ilkesi
Kütle spektrometresi molekülleri doğrudan tartmaz. Önce onları elektrik yüklü parçacıklara, yani iyonlara dönüştürür; ardından bu iyonları elektrik ya da manyetik alanlardaki davranışlarına göre ayırır. Ölçülen büyüklük kütlenin kendisi değil, kütlenin yüke oranıdır ve m/z olarak gösterilir. Sonuç, yatay ekseninde m/z, dikey ekseninde sinyal şiddeti bulunan bir spektrumdur.
| Bileşen | Görevi | Yaygın örnekler |
|---|---|---|
| İyon kaynağı | Molekülü bozmadan yüklü hâle getirir | Elektrosprey, matriks destekli lazer iyonlaştırma |
| Kütle analizörü | İyonları m/z değerine göre ayırır | Uçuş süresi, kuadrupol, iyon tuzağı |
| Dedektör | Ayrılan iyonları sayar | Elektron çoğaltıcı ve benzeri sistemler |
Peptidler gibi büyük ve kırılgan moleküller için yumuşak iyonlaştırma yöntemleri geliştirilmiştir. Elektrosprey yönteminde çözelti ince bir iğneden yüksek gerilim altında püskürtülür; damlacıklar buharlaşırken moleküller yüklü hâlde gaz fazına geçer. Bu yaklaşım sıvı kromatografiye doğrudan bağlanabildiği için ayrım ve ölçüm tek akışta yürütülebilir. Matriks destekli lazer yönteminde ise numune, ışığı soğuran bir yardımcı maddeyle birlikte kurutulur ve kısa lazer atımlarıyla iyonlaştırılır.
Yük durumları ve kütle bilgisi
Elektrosprey ile iyonlaşan bir peptid çoğunlukla birden fazla proton taşır. Aynı molekül bu nedenle spektrumda tek bir çizgi olarak değil, farklı yük sayılarına karşılık gelen bir tepe dizisi hâlinde görünür. Yazılım bu diziden yola çıkarak molekülün yüksüz kütlesini geri hesaplar; bu işleme dekonvolüsyon denir.
Ölçüm hassasiyeti yüksek cihazlarda, molekülün doğal kararlı izotoplarından kaynaklanan ince yapı da ayırt edilebilir. Bu ayrıntı iki bakımdan işe yarar: komşu tepelerin arasındaki uzaklık yük sayısını doğrudan gösterir, izotop deseninin biçimi ise okunan sinyalin gerçekten bir peptide ait olup olmadığı konusunda fikir verir.
Ölçümün doğruluğu cihazın düzenli kalibre edilmesine bağlıdır. Kalibrasyon, kütlesi bilinen standart karışımlarla yapılır; bazı çalışmalarda numuneyle birlikte sürekli verilen bir iç standart kullanılarak sapma çalışma boyunca düzeltilir. Kalibrasyonun ne zaman yapıldığı da rapor edilen sonucun parçasıdır.
Kütle bilgisi, disülfit köprülerinin durumu hakkında da ipucu taşır. Köprüler kurulurken molekülden hidrojen ayrıldığı için katlanmış bir peptid, indirgenmiş hâlinden bir miktar daha hafiftir; aynı numunenin iki hâli ölçüldüğünde bu fark görülebilir. Köprülerin yapıdaki rolü disülfit köprüleri yazısında ele alındı.
MS/MS: dizi bilgisine ulaşmak
Yalnız kütle, bir peptidi kesin olarak tanımlamak için çoğu zaman yetmez. Aynı kütleye sahip farklı diziler bulunabilir. Bu nedenle tandem kütle spektrometrisi, kısaca MS/MS kullanılır.
Yaklaşım üç adımdan oluşur. İlk analizörde ilgilenilen iyon seçilir; ardından bir çarpışma hücresinde inert gaz molekülleriyle çarpıştırılarak kontrollü biçimde parçalanır; son olarak ortaya çıkan parçaların m/z değerleri ölçülür. Peptid zinciri çoğunlukla aminoasitleri birbirine bağlayan bağlardan kopar, dolayısıyla parçalar birbirinden birer aminoasit farkla sıralanır. Komşu iki parçanın kütle farkı, aradaki aminoasidin kimliğini verir; parça dizisi baştan sona izlendiğinde dizinin bir bölümü ya da tamamı okunabilir.
Okuma her zaman kusursuz olmaz. Bazı aminoasit çiftlerinin kütlesi birbirine çok yakın ya da eşittir; lösin ile izolösin standart koşullarda ayırt edilemez. Ayrıca zincirin her bağı aynı kolaylıkla kopmaz, bu yüzden bazı bölgeler için parça sinyali zayıf kalabilir. Bu boşluklar çoğunlukla farklı parçalama yöntemleri ya da farklı enzimlerle hazırlanmış örneklerle kapatılır.
İki temel yaklaşım
- Bütün molekülün ölçülmesi: Peptid parçalanmadan olduğu gibi ölçülür. Küçük ve köprülerle sabitlenmiş venom peptidleri için hızlı bir profil çıkarma yoludur.
- Enzimle parçalayarak ölçme: Protein önce belirli bağlardan kesen bir enzimle küçük parçalara ayrılır, sonra parçalar ölçülür. Büyük proteinler ve enzim içeriği için tercih edilir.
Elde edilen veriler, bilinen dizilerin toplandığı veritabanlarıyla karşılaştırılır. Yazılım, ölçülen kütleleri ve parça desenlerini kayıtlı dizilerden beklenen değerlerle eşleştirir ve her eşleşme için bir güven ölçütü üretir. Eşleşmenin rastlantısal olma olasılığı, aramanın ters çevrilmiş dizilerle yeniden yapılması gibi yöntemlerle tahmin edilir.
Yeni türlerde sınırlar
Veritabanı araması, aranan dizinin kayıtlarda bulunmasına dayanır. Az çalışılmış ya da yeni tanımlanmış bir türün venomunda ise pek çok bileşenin dizisi henüz kayıtlı değildir. Bu durumda iki yol izlenir: dizi doğrudan spektrumdan okunmaya çalışılır ya da türün venom bezinden elde edilen gen dizisi verileriyle bir arama kütüphanesi oluşturulur. İkinci yaklaşım, transkriptom ve proteom verilerini birleştirdiği için venom araştırmalarında yaygınlaşmıştır.
Böyle durumlarda sonuç çoğu zaman kesin bir ad yerine ailece bir yerleştirme olur: bileşen, bilinen bir peptid ailesine benzediği ölçüde sınıflandırılır. Referans parti raporumuzda tanımlanan peptidin bir sınıf adıyla, α-KTx 3.6 olarak verilmesi de bu yaklaşımın örneğidir; ailenin genel özellikleri α-KTx yazısında anlatıldı.
Diğer yöntemlerle birlikte
Kütle spektrometrisi tek başına çalışan bir yöntem değildir. Numune çoğunlukla önce kromatografiyle ayrıştırılır; ayrım yaklaşımı HPLC yazısında, molekül ağırlığı dağılımını jel üzerinde gösteren yöntem ise SDS-PAGE yazısında ele alındı. Bu yöntemler aynı numuneye farklı sorular sorar; birbirini doğrulayan sonuçlar bir araya geldiğinde tanımlama güçlenir.
Referans partimize ait raporda uygulanan yöntemler ve elde edilen değerler analiz sayfasında yayımlanmaktadır. Sonuçların partiye özgü olduğunu ve her parti için ölçümlerin yeniden yapıldığını belirtmek gerekir.
