Хроматография разделяет яд на компоненты, но не говорит, что представляют собой полученные пики. Чтобы установить идентичность компонента, нужно знать его массу и, по возможности, аминокислотную последовательность. Масс-спектрометрия способна дать обе эти характеристики одновременно и является одним из основных инструментов идентификации пептидов в исследованиях ядов.
Принцип метода
Масс-спектрометр не взвешивает молекулы напрямую. Сначала он превращает их в электрически заряженные частицы — ионы, а затем разделяет эти ионы по их поведению в электрических или магнитных полях. Измеряемая величина — не сама масса, а отношение массы к заряду, обозначаемое m/z. Результат — спектр, по горизонтальной оси которого отложено m/z, а по вертикальной — интенсивность сигнала.
| Узел | Функция | Распространённые варианты |
|---|---|---|
| Источник ионов | Переводит молекулу в заряженное состояние, не разрушая её | Электрораспыление, матрично-активированная лазерная ионизация |
| Масс-анализатор | Разделяет ионы по значению m/z | Времяпролётный, квадрупольный, ионная ловушка |
| Детектор | Подсчитывает разделённые ионы | Электронный умножитель и аналогичные системы |
Для крупных и хрупких молекул, таких как пептиды, разработаны методы мягкой ионизации. При электрораспылении раствор распыляют из тонкой иглы под высоким напряжением; по мере испарения капель молекулы переходят в газовую фазу в заряженном состоянии. Поскольку такой источник можно напрямую соединить с жидкостной хроматографией, разделение и измерение выполняются в едином потоке. В методе матрично-активированной лазерной ионизации пробу высушивают вместе со вспомогательным веществом, поглощающим свет, и ионизируют короткими лазерными импульсами.
Зарядовые состояния и информация о массе
Пептид, ионизированный электрораспылением, как правило, несёт несколько протонов. Поэтому одна и та же молекула выглядит в спектре не одной линией, а серией пиков, соответствующих разному числу зарядов. Исходя из этой серии, программа рассчитывает массу незаряженной молекулы; эта операция называется деконволюцией.
На приборах с высокой точностью измерения можно различить и тонкую структуру, обусловленную естественными стабильными изотопами молекулы. Эта деталь полезна в двух отношениях: расстояние между соседними пиками прямо указывает число зарядов, а форма изотопного распределения позволяет судить, действительно ли регистрируемый сигнал принадлежит пептиду.
Точность измерения зависит от регулярной калибровки прибора. Калибровку проводят по стандартным смесям с известными массами; в некоторых работах используют внутренний стандарт, непрерывно подаваемый вместе с пробой, что позволяет корректировать дрейф на протяжении всего анализа. Дата калибровки также входит в состав сообщаемого результата.
Информация о массе содержит и подсказку о состоянии дисульфидных мостиков. Поскольку при образовании мостиков от молекулы отщепляется водород, свёрнутый пептид несколько легче своей восстановленной формы; при измерении обеих форм одной и той же пробы эта разница заметна. Роль мостиков в структуре рассмотрена в статье о дисульфидных мостиках.
MS/MS: получение сведений о последовательности
Одной массы зачастую недостаточно для однозначной идентификации пептида: одинаковую массу могут иметь разные последовательности. Поэтому применяют тандемную масс-спектрометрию, сокращённо MS/MS.
Подход состоит из трёх этапов. В первом анализаторе выбирают интересующий ион; затем в ячейке соударений его контролируемо фрагментируют столкновениями с молекулами инертного газа; наконец, измеряют значения m/z образовавшихся фрагментов. Пептидная цепь разрывается преимущественно по связям между аминокислотами, поэтому фрагменты выстраиваются в ряд, отличаясь друг от друга на одну аминокислоту. Разность масс двух соседних фрагментов указывает на аминокислоту между ними; проследив ряд фрагментов от начала до конца, можно прочитать часть последовательности или её целиком.
Прочтение не всегда безупречно. Массы некоторых пар аминокислот очень близки или совпадают: лейцин и изолейцин в стандартных условиях не различаются. Кроме того, не все связи цепи разрываются одинаково легко, поэтому для некоторых участков сигнал фрагментов может оставаться слабым. Такие пробелы обычно закрывают с помощью других методов фрагментации или проб, подготовленных с другими ферментами.
Два основных подхода
- Измерение целой молекулы: пептид измеряют без расщепления. Это быстрый способ получить профиль небольших пептидов яда, стабилизированных мостиками.
- Измерение после ферментативного расщепления: белок сначала расщепляют на небольшие фрагменты ферментом, разрезающим определённые связи, а затем измеряют эти фрагменты. Подход предпочтителен для крупных белков и ферментной составляющей яда.
Полученные данные сравнивают с базами данных, в которых собраны известные последовательности. Программа сопоставляет измеренные массы и картины фрагментации со значениями, ожидаемыми для зарегистрированных последовательностей, и для каждого совпадения рассчитывает показатель достоверности. Вероятность случайного совпадения оценивают, например, повторяя поиск по инвертированным последовательностям.
Ограничения для новых видов
Поиск по базе данных предполагает, что искомая последовательность в ней зарегистрирована. Однако в яде малоизученного или недавно описанного вида последовательности многих компонентов ещё не внесены в базы. В этом случае идут одним из двух путей: пытаются прочитать последовательность непосредственно по спектру либо создают поисковую библиотеку на основе данных о генных последовательностях из ядовитой железы вида. Второй подход, объединяющий данные транскриптома и протеома, получил широкое распространение в исследованиях ядов.
В таких случаях результатом часто становится не точное название, а отнесение к семейству: компонент классифицируют по его сходству с известным семейством пептидов. Пример такого подхода — пептид, идентифицированный в протоколе нашей референсной партии: он указан под названием класса, α-KTx 3.6; общие свойства семейства описаны в статье об α-KTx.
В сочетании с другими методами
Масс-спектрометрия не применяется изолированно. Пробу обычно сначала разделяют хроматографией; подход к разделению рассмотрен в статье о ВЭЖХ (HPLC), а метод, показывающий распределение молекулярных масс в геле, — в статье о SDS-PAGE. Эти методы задают одной и той же пробе разные вопросы; когда взаимно подтверждающие результаты сходятся, идентификация становится надёжнее.
Методы, применённые в протоколе нашей референсной партии, и полученные значения публикуются на странице анализа. Следует подчеркнуть, что результаты относятся к конкретной партии и для каждой партии измерения проводятся заново.
