تفصل الكروماتوغرافيا السمَّ إلى مكوّناته، لكنها لا تقول ما هي القمم المفصولة. ولتحديد هوية مكوّن يلزم معرفة كتلته، وتسلسل أحماضه الأمينية إن أمكن. ومطيافية الكتلة هي الطريقة القادرة على إعطاء هاتين المعلومتين معًا، وهي من الأدوات الأساسية لتعريف الببتيدات في أبحاث السموم.
مبدأ الطريقة
لا يزن مطياف الكتلة الجزيئات مباشرة. بل يحوّلها أولًا إلى جسيمات مشحونة كهربائيًا، أي أيونات؛ ثم يفصل هذه الأيونات بحسب سلوكها في المجالات الكهربائية أو المغناطيسية. والمقدار المقيس ليس الكتلة نفسها، بل نسبة الكتلة إلى الشحنة، ويُرمز إليها بـ m/z. والنتيجة طيفٌ محورُه الأفقي m/z ومحورُه الرأسي شدة الإشارة.
| المكوّن | وظيفته | أمثلة شائعة |
|---|---|---|
| مصدر الأيونات | يجعل الجزيء مشحونًا دون إتلافه | الرذاذ الكهربائي، والتأيين بالليزر بمساعدة المطرس |
| محلّل الكتلة | يفصل الأيونات بحسب قيمة m/z | زمن التحليق، والرباعي القطبي، ومصيدة الأيونات |
| الكاشف | يعدّ الأيونات المفصولة | مضاعف الإلكترونات والمنظومات المشابهة |
وقد طُوِّرت طرق تأيين لطيفة للجزيئات الكبيرة الهشّة مثل الببتيدات. ففي طريقة الرذاذ الكهربائي يُرشّ المحلول من إبرة رفيعة تحت جهد عالٍ؛ وبينما تتبخر القطيرات تنتقل الجزيئات إلى الطور الغازي وهي مشحونة. ولأن هذا النهج يمكن وصله مباشرة بالكروماتوغرافيا السائلة، يمكن إجراء الفصل والقياس في مسار واحد. أما في طريقة الليزر بمساعدة المطرس فتُجفَّف العيّنة مع مادة مساعدة تمتص الضوء، ثم تُؤيَّن بنبضات ليزر قصيرة.
حالات الشحن ومعلومات الكتلة
الببتيد المتأيّن بالرذاذ الكهربائي يحمل في الغالب أكثر من بروتون واحد. ولهذا لا يظهر الجزيء نفسه في الطيف خطًا واحدًا، بل سلسلةَ قمم تقابل أعدادًا مختلفة من الشحنات. وينطلق البرنامج من هذه السلسلة ليعيد حساب كتلة الجزيء غير المشحون؛ وتُسمّى هذه العملية فكّ الالتفاف.
وفي الأجهزة العالية الدقة يمكن تمييز البنية الدقيقة الناشئة عن النظائر المستقرة الطبيعية للجزيء. وهذه التفصيلة نافعة من وجهين: فالمسافة بين القمم المتجاورة تدل مباشرة على عدد الشحنات، أما شكل نمط النظائر فيعطي فكرة عمّا إذا كانت الإشارة المقروءة تعود فعلًا إلى ببتيد.
ودقة القياس مرهونة بمعايرة الجهاز بانتظام. وتُجرى المعايرة بمخاليط معيارية معلومة الكتلة؛ وفي بعض الدراسات يُستخدم معيار داخلي يُعطى باستمرار مع العيّنة فيُصحَّح الانحراف طوال التشغيل. ووقتُ إجراء المعايرة هو أيضًا جزء من النتيجة المبلَّغة.
وتحمل معلوماتُ الكتلة قرينةً كذلك عن حالة الجسور ثنائية الكبريتيد. فلأن الهيدروجين يُنزع من الجزيء عند تكوّن الجسور، يكون الببتيد المطوي أخفّ قليلًا من حالته المختزلة؛ ويمكن رؤية هذا الفرق عند قياس حالتَي العيّنة نفسها. وقد نُوقش دور الجسور في البنية في مقال الجسور ثنائية الكبريتيد.
MS/MS: الوصول إلى معلومات التسلسل
الكتلة وحدها لا تكفي في الغالب لتعريف ببتيد تعريفًا قاطعًا. فقد توجد تسلسلات مختلفة لها الكتلة نفسها. ولهذا تُستخدم مطيافية الكتلة الترادفية، واختصارًا MS/MS.
ويتألف النهج من ثلاث خطوات. يُنتقى في المحلّل الأول الأيون المعني؛ ثم يُشظَّى على نحو مضبوط بتصادمه مع جزيئات غاز خامل في خلية تصادم؛ وأخيرًا تُقاس قيم m/z للشظايا الناتجة. وسلسلة الببتيد تنكسر في الغالب عند الروابط التي تصل الأحماض الأمينية بعضها ببعض، فتترتب الشظايا بفارق حمض أميني واحد بين الواحدة والأخرى. وفرقُ الكتلة بين شظيتين متجاورتين يعطي هوية الحمض الأميني الواقع بينهما؛ وبتتبّع سلسلة الشظايا من أولها إلى آخرها يمكن قراءة جزء من التسلسل أو التسلسل كله.
والقراءة ليست كاملة دائمًا. فكتلة بعض أزواج الأحماض الأمينية متقاربة جدًا أو متساوية؛ فاللوسين والآيزولوسين لا يمكن التمييز بينهما في الظروف المعيارية. كما أن روابط السلسلة لا تنكسر جميعها بالسهولة نفسها، ولذلك قد تبقى إشارة الشظايا ضعيفة في بعض المناطق. وتُسدّ هذه الثغرات في الغالب بطرق تشظٍّ مختلفة، أو بعيّنات محضَّرة بإنزيمات مختلفة.
نهجان أساسيان
- قياس الجزيء كاملًا: يُقاس الببتيد كما هو دون تشظية. وهي طريقة سريعة لاستخراج ملف ببتيدات السم الصغيرة المثبَّتة بالجسور.
- القياس بعد التفكيك الإنزيمي: يُقطَّع البروتين أولًا إلى أجزاء صغيرة بإنزيم يقصّ عند روابط محددة، ثم تُقاس الأجزاء. ويُفضَّل هذا للبروتينات الكبيرة ولمحتوى الإنزيمات.
وتُقارَن البيانات المتحصَّلة بقواعد بيانات تُجمع فيها التسلسلات المعروفة. ويطابق البرنامج الكتلَ المقيسة وأنماطَ الشظايا بالقيم المتوقعة من التسلسلات المسجَّلة، ويُنتج لكل مطابقة مقياسَ ثقة. ويُقدَّر احتمال أن تكون المطابقة عشوائية بطرق منها إعادة البحث بتسلسلات معكوسة.
الحدود في الأنواع الجديدة
يستند البحث في قواعد البيانات إلى وجود التسلسل المطلوب في السجلات. أما في سمّ نوع قليل الدراسة أو حديث الوصف، فإن تسلسل كثير من المكوّنات لم يُسجَّل بعد. ويُسلك في هذه الحال طريقان: إما أن يُحاوَل قراءةُ التسلسل من الطيف مباشرة، وإما أن تُبنى مكتبة بحث من بيانات تسلسل الجينات المستخلصة من غدة السم لدى النوع. وقد شاع النهج الثاني في أبحاث السموم لأنه يجمع بيانات النسخ والبروتيوم.
وفي مثل هذه الحالات تكون النتيجة في الغالب وضعًا ضمن عائلة بدلًا من اسم قاطع: إذ يُصنَّف المكوّن بقدر شبهه بعائلة ببتيدات معروفة. وإعطاءُ الببتيد المعرَّف في تقرير دفعتنا المرجعية باسم صنف، أي α-KTx 3.6، مثالٌ على هذا النهج؛ وقد شُرحت الخصائص العامة للعائلة في مقال α-KTx.
مع الطرق الأخرى
ومطيافية الكتلة ليست طريقة تعمل وحدها. فالعيّنة تُفصل في الغالب بالكروماتوغرافيا أولًا؛ وقد نُوقش نهج الفصل في مقال HPLC، أما الطريقة التي تُظهر توزّع الوزن الجزيئي على هلام ففي مقال SDS-PAGE. وهذه الطرق تطرح أسئلة مختلفة على العيّنة نفسها؛ وحين تجتمع نتائج يؤكد بعضها بعضًا يقوى التعريف.
وتُنشَر في صفحة التحليل الطرقُ المطبَّقة والقيمُ المتحصَّلة في التقرير الخاص بدفعتنا المرجعية. وتجدر الإشارة إلى أن النتائج خاصة بالدفعة وأن القياسات تُعاد لكل دفعة.
