تقنية مشبك الرقعة (patch clamp) طريقة في الفيزيولوجيا الكهربائية تُستخدم لقياس التيارات الكهربائية الضئيلة جدًا التي تمر عبر القنوات الأيونية في غشاء خلية واحدة. وقد نال مطوّرا الطريقة، إرفين نيهر وبرت ساكمان، جائزة نوبل في الفيزيولوجيا أو الطب لعام 1991 لاكتشافاتهما المتعلقة بوظيفة القنوات الأيونية المفردة. وهي اليوم من أدوات القياس الأساسية في دراسة الجزيئات التي تؤثر في القنوات الأيونية، ومنها ببتيدات السم.
يرتبط جزء كبير من الببتيدات الموجودة في سم العقرب بقنوات البوتاسيوم أو الصوديوم أو الكلوريد. وتُحدَّد القناة التي يؤثر فيها الببتيد، وقوة هذا التأثير ومدى انتقائيته، إلى حد بعيد بقياسات مشبك الرقعة. يعرض هذا المقال بإيجاز المبدأ الأساسي للطريقة، وأوضاع التسجيل المستخدمة، وكيف تُقرأ نتيجة القياس.
المبدأ الأساسي للطريقة
تُملأ ماصّة زجاجية دقيقة يبلغ قطر طرفها نحو ميكرومتر واحد بمحلول موصل، ثم تُلامَس بها غشاء الخلية. وعند تطبيق شفط خفيف يتكوّن تماس شديد الإحكام بين الزجاج والغشاء، تبلغ مقاومته مستوى الجيجا أوم، أي مليارات الأومات، ولذلك يُسمى «الختم الجيجا أومي» (gigaseal). وبفضل هذا العزل الجيد يمكن تمييز التيارات التي تبلغ مستوى البيكو أمبير، المارة عبر رقعة الغشاء الصغيرة عند طرف الماصّة، عن الضجيج.
وتُجرى القياسات غالبًا في وضع تثبيت الجهد (voltage clamp): إذ يُبقي المضخِّم جهد الغشاء عند القيمة التي يحددها الباحث ويسجل التيار اللازم لذلك. وهذا التيار المسجَّل هو نفسه التيار المار عبر القنوات الأيونية المفتوحة في تلك اللحظة. أما في وضع تثبيت التيار (current clamp) فيُثبَّت التيار ويُسجَّل تغيّر جهد الغشاء، ويُستخدم هذا الوضع أساسًا لدراسة السلوك الكهربائي للخلايا العصبية.
ويُدوَّن مع كل قياس تركيب المحاليل داخل الخلية وخارجها ودرجة الحرارة وخطوات الجهد المطبقة، إذ لا يمكن مقارنة نتائج المختبرات المختلفة إلا عند معرفة هذه الظروف.
أوضاع التسجيل الأساسية الأربعة
| الوضع | كيف يُنشأ؟ | ماذا يُقاس؟ |
|---|---|---|
| الالتصاق بالخلية (cell-attached) | تلتصق الماصّة بالغشاء ويبقى الغشاء سليمًا | تيارات القناة المفردة لعدد قليل من القنوات تحت الماصّة |
| الخلية الكاملة (whole-cell) | يُثقب الغشاء تحت الماصّة فتنفتح الماصّة على داخل الخلية | التيار الكلي لجميع قنوات الخلية |
| الداخل إلى الخارج (inside-out) | تُنتزع رقعة من الغشاء ويتجه وجهها الداخلي نحو المحلول | تأثير المواد المطبقة على الجانب الداخلي للخلية |
| الخارج إلى الخارج (outside-out) | تُحصَّل رقعة غشاء صغيرة بسحب الماصّة من وضع الخلية الكاملة | تأثير المواد المطبقة على الوجه الخارجي، مثل السموم |
ولأن ببتيدات السم ترتبط بالقنوات غالبًا من الوجه الخارجي للخلية، يُستخدم وضع الخلية الكاملة أكثر من غيره في دراسات الفرز: يُضاف الببتيد إلى المحلول المحيط بالخلية ويُتابَع التغير في التيار.
كيف تُختبر ببتيدات السم؟
تُنتَج القناة المدروسة عادةً في سلالة خلوية نُقل إليها جينها، فيأتي معظم التيار المقيس من نوع واحد من القنوات. ثم تُتَّبع الخطوات الآتية:
- يُسجَّل مستوى أساسي مستقر لتيار القناة قبل إضافة الببتيد.
- يُطبَّق الببتيد بتراكيز متزايدة، ويُقاس عند كل تركيز مقدار انخفاض التيار أو تغيّره.
- يُغسل الببتيد من الوسط للتحقق من انعكاس التأثير.
- يُحسب من منحنى التركيز والاستجابة التركيزُ الذي يخفّض التيار إلى النصف (IC50).
- تُكرَّر القياسات نفسها على أنواع فرعية أخرى من القنوات لتحديد الانتقائية.
وتُعبَّر الانتقائية بالنسبة بين قيم IC50 للببتيد نفسه على القنوات المختلفة، وكلما كبرت النسبة زادت قدرة الببتيد على تمييز القناة المستهدفة عن غيرها.
وتُعدّ الدراسات على قنوات Kv1 مثالًا نموذجيًا على هذا النهج: فبمقارنة قيم IC50 لببتيد من عائلة α-KTx على Kv1.1 وKv1.2 وKv1.3 يُعرف إلى أي قناة هو أكثر انتقائية. أما في سموم قنوات الصوديوم فلا يُتابَع انخفاض التيار بقدر ما يُتابَع تغيّر سلوك انفتاح القناة وانغلاقها، وقد شرحنا خصائص هذه العائلة في مقال سموم قنوات الصوديوم.
مشبك الرقعة الآلي وحدود الطريقة
تتطلب الطريقة التقليدية أن يعمل باحث متمرّس على الخلايا واحدة تلو الأخرى تحت المجهر، ولا يمكن الحصول إلا على عدد محدود من التسجيلات في اليوم. أما أنظمة مشبك الرقعة الآلية فتستخدم بدل الماصّات رقاقات مسطحة ذات ثقوب صغيرة وتقيس خلايا كثيرة في وقت واحد، فيتسارع بذلك فرز أعداد كبيرة من الجزيئات.
وينبغي مراعاة بعض الحدود عند تفسير النتائج: فالقناة المنتَجة في سلالة خلوية قد تتصرف بشكل مختلف عن القناة الطبيعية في النسيج، ومعرفة نقاء الببتيد وتركيزه بدقة تؤثر مباشرة في قيمة IC50. لذلك تعطي القياسات التي تُجرى على ببتيدات مفصولة ومؤكدة الهوية نتائج أكثر موثوقية من القياسات على السم الخام. ولمعرفة الملف التحليلي للسم الخام راجع صفحة نتائج التحليل.
