Пэтч-кламп (метод локальной фиксации потенциала) — электрофизиологический метод, позволяющий измерять очень слабые электрические токи, проходящие через ионные каналы мембраны отдельной клетки. Разработавшие метод Эрвин Неер и Берт Сакман получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине 1991 года за открытия, касающиеся функции одиночных ионных каналов. Сегодня это один из основных измерительных инструментов для изучения молекул, действующих на ионные каналы, включая пептиды яда.
Значительная часть пептидов яда скорпиона связывается с калиевыми, натриевыми или хлорными каналами. На какой канал действует пептид, насколько сильно и насколько избирательно, во многом определяют именно измерения пэтч-кламп. В статье в общих чертах описаны основной принцип метода, применяемые конфигурации записи и то, как читается результат измерения.
Основной принцип метода
Стеклянную микропипетку с кончиком порядка микрометра заполняют проводящим раствором и подводят к клеточной мембране. При лёгком подсасывании между стеклом и мембраной образуется очень плотный контакт. Сопротивление этого контакта составляет гигаомы, то есть миллиарды ом, поэтому его называют «гигаконтактом» (gigaseal). При столь хорошей изоляции токи пикоамперного уровня, проходящие через маленький участок мембраны под кончиком пипетки, можно отличить от шума.
Чаще всего измерения проводят в режиме фиксации потенциала (voltage clamp): усилитель удерживает мембранный потенциал на заданном исследователем уровне и регистрирует ток, необходимый для этого. Зарегистрированный ток — это и есть ток через ионные каналы, открытые в данный момент. В режиме фиксации тока (current clamp), напротив, ток поддерживается постоянным и регистрируются изменения мембранного потенциала; этот режим используют главным образом для изучения электрического поведения нервных клеток.
Вместе с каждым измерением записывают состав внутри- и внеклеточного растворов, температуру и применённые ступени потенциала. Результаты разных лабораторий можно сравнивать только тогда, когда эти условия известны.
Четыре основные конфигурации записи
| Конфигурация | Как создаётся | Что измеряется |
|---|---|---|
| «Прикреплённая клетка» (cell-attached) | Пипетка присасывается к мембране, мембрана остаётся целой | Одиночные токи нескольких каналов под пипеткой |
| «Целая клетка» (whole-cell) | Мембрану под пипеткой прорывают, пипетка открывается внутрь клетки | Суммарный ток всех каналов клетки |
| «Изнутри наружу» (inside-out) | Участок мембраны отрывают, его внутренняя сторона обращена к раствору | Действие веществ, нанесённых на внутриклеточную сторону |
| «Снаружи наружу» (outside-out) | Небольшой участок мембраны получают, отводя пипетку из конфигурации «целая клетка» | Действие веществ, нанесённых на наружную сторону, например токсинов |
Поскольку пептиды яда обычно связываются с каналами с наружной стороны клетки, в скрининговых исследованиях чаще всего используют конфигурацию «целая клетка»: пептид добавляют в раствор, окружающий клетку, и следят за изменением тока.
Как испытывают пептиды яда?
Исследуемый канал обычно получают в клеточной линии, в которую введён его ген; благодаря этому основная часть измеряемого тока приходится на один тип канала. Далее выполняют следующие шаги:
- До добавления пептида регистрируют стабильный исходный уровень тока канала.
- Пептид вводят в возрастающих концентрациях и при каждой концентрации измеряют, насколько уменьшился или изменился ток.
- Пептид отмывают, чтобы проверить, обратим ли эффект.
- По кривой «концентрация — ответ» рассчитывают концентрацию, снижающую ток вдвое (IC50).
- Те же измерения повторяют на других подтипах каналов, чтобы определить избирательность.
Избирательность выражают отношением значений IC50 одного и того же пептида для разных каналов: чем больше это отношение, тем лучше пептид отличает целевой канал от остальных.
Типичный пример такого подхода — исследования каналов Kv1: сравнивая значения IC50 пептида α-KTx для Kv1.1, Kv1.2 и Kv1.3, выясняют, к какому каналу он избирательнее. У токсинов натриевых каналов следят не столько за уменьшением тока, сколько за изменением открывания и закрывания канала; особенности этого семейства описаны в статье о токсинах натриевых каналов.
Автоматический пэтч-кламп и ограничения
Классический пэтч-кламп требует, чтобы опытный исследователь работал с клетками по одной под микроскопом, и за день удаётся получить лишь ограниченное число записей. Автоматические системы пэтч-кламп вместо пипеток используют планарные чипы с маленькими отверстиями и измеряют множество клеток одновременно, что ускоряет скрининг большого числа молекул.
При интерпретации результатов нужно помнить об ограничениях: канал, полученный в клеточной линии, может вести себя иначе, чем природный канал в ткани, а точное знание чистоты и концентрации пептида напрямую влияет на значение IC50. Поэтому измерения с разделёнными пептидами с подтверждённой идентичностью дают более надёжные результаты, чем измерения с нативным ядом. Аналитический профиль нативного яда приведён на нашей странице результатов анализа.
