Высокоэффективная жидкостная хроматография, сокращённо ВЭЖХ (HPLC), — аналитический метод, позволяющий разделить компоненты смеси и сделать каждый отделённый компонент видимым по отдельности. Для образцов, содержащих десятки компонентов, таких как яд, это самый распространённый способ получения профиля.
Слова «высокоэффективная» в названии метод обязан мелкозернистому сорбенту. Чем мельче частицы, тем чётче разделение, но тем выше и сопротивление потоку; чтобы его преодолеть, нужны насосы, работающие при высоком давлении. В современных системах насос, узел ввода пробы, термостат колонки и детектор управляются совместно на единой линии потока, а все условия регистрируются программным обеспечением.
Принцип работы
Сердце системы — колонка, плотно заполненная сорбентом. Насос под высоким давлением прокачивает через неё растворитель, называемый подвижной фазой. Когда проба вводится в поток, каждый компонент взаимодействует с сорбентом (неподвижной фазой) и растворителем с разной силой. Компонент, сильнее удерживаемый неподвижной фазой, дольше остаётся в колонке, а слабо удерживаемый выходит раньше. Детектор на выходе колонки измеряет проходящее вещество и строит зависимость сигнала от времени; этот график называется хроматограммой.
Для воспроизводимости важно поддерживать постоянную температуру колонки: при её изменении меняется и удерживание компонентов, и пики смещаются. По той же причине перед каждым анализом колонку уравновешивают в начальных условиях. Модель прибора, тип колонки и условия программы указывают в протоколах для того, чтобы результат можно было воспроизвести в другой лаборатории. При анализе референсной партии разделение выполнено на системе Shimadzu Prominence-i LC2030 3D.
Что значит «обращённая фаза»?
В классической нормально-фазовой хроматографии неподвижная фаза полярна, а подвижная — неполярна. В обращённо-фазовом варианте (RP-HPLC) это соотношение обращено: неподвижную фазу делают неполярной за счёт длинных углеводородных цепей, привитых к поверхности силикагеля, а подвижная фаза — водная и полярная. Таким образом, разделение идёт по гидрофобности молекул. Поскольку пептиды несут как гидрофильные, так и гидрофобные участки поверхности, этот подход стал стандартом в анализе пептидов.
На практике состав подвижной фазы не оставляют постоянным. В начале она состоит преимущественно из воды, а затем доля органического растворителя постепенно увеличивается. При таком градиентном элюировании гидрофильные компоненты выходят рано, гидрофобные — поздно, и широкий диапазон полярности охватывается за один анализ. При анализе референсной партии использовались обращённо-фазовая колонка и пологий градиент с повышением доли органического растворителя от нуля до шестидесяти процентов.
Почему детекция при 280 nm?
Белки и пептиды поглощают свет в области около 280 нанометров благодаря остаткам триптофана и тирозина в их составе. Регистрация на этой длине волны избирательно делает видимыми белоксодержащие пики и одновременно ограничивает шум от компонентов буфера. Физика поглощения рассматривается в статье об измерении при 280 nm.
Этапы анализа
- Образец взвешивают и готовят в подходящем растворителе с заданной концентрацией; при анализе референсной партии образец растворён в концентрации 1000 ppm.
- Раствор фильтруют для удаления частиц; этот этап не пропускают, чтобы не забить колонку.
- Колонку уравновешивают в начальных условиях.
- Вводят пробу и запускают градиентную программу.
- Регистрируют сигнал детектора; пики оценивают по времени удерживания и площади.
- При необходимости пики собирают по отдельности и передают на последующие анализы.
Большинство проблем связано с пробоподготовкой. Нерастворившиеся частицы забивают вход колонки, а неподходящий растворитель искажает форму пиков. Поэтому образец готовят в растворителе, близком к начальному составу подвижной фазы, и фильтруют перед вводом. Разумный объём вводимой пробы, соответствующий колонке, также предотвращает уширение пиков.
О чём говорит хроматограмма?
| Показатель | Значение |
|---|---|
| Время удерживания | Момент выхода компонента из колонки; воспроизводимая характеристика в одинаковых условиях |
| Площадь пика | Связана с относительным количеством компонента |
| Число пиков | Показывает число разделяемых компонентов |
| Ширина пика | Даёт сведения об эффективности разделения и состоянии колонки |
| Базовая линия | Её дрейф указывает на проблемы, связанные с системой или градиентом |
При анализе референсной партии при 280 nm разрешено 37 белков и пептидов. Нужно помнить, что это число зависит от условий: при изменении типа колонки, крутизны градиента и длины волны детекции из того же образца можно получить другое число пиков. Подробнее о чтении хроматограммы — в статье о хроматограмме.
Площади пиков чаще всего оценивают в относительных величинах. Чтобы выразить количество компонента в абсолютных единицах, нужна калибровка по растворам того же компонента с известными концентрациями. Поскольку для большинства компонентов яда чистых стандартов нет, профиль используется не столько как количественное измерение, сколько как сравнительный «отпечаток пальцев».
Разделённые пики можно не только наблюдать, но и собирать. Если поток на выходе колонки распределять по времени в отдельные ёмкости, каждый пик получают в виде собственной фракции. Эти фракции можно лиофилизировать, хранить и в последующих анализах работать с ними как с отдельными компонентами. Выделение интересующего пептида из сложной смеси обычно начинается именно так. Если не записать, из какого анализа и из какого временного интервала получена собранная фракция, её идентичность будет утрачена; поэтому план сбора составляют до анализа.
Предел метода
ВЭЖХ разделяет компоненты, но сама по себе не сообщает, что это за компоненты. Чтобы установить, какому пептиду соответствует пик, нужны молекулярная масса и сведения о последовательности; поэтому хроматографию обычно сочетают с такими методами, как SDS-PAGE и масс-спектрометрия. Вся схема наших анализов кратко изложена на странице анализа.
