Хроматограмма — это график, который получают по завершении хроматографического анализа и который показывает сигнал детектора во времени. На первый взгляд он напоминает цепочку горных силуэтов. При правильном прочтении он показывает, сколько компонентов пробы удалось разделить, каково их соотношение и насколько надёжно разделение. Принцип метода описан в статье о ВЭЖХ (HPLC); эта статья посвящена интерпретации полученного графика.
Оси и основные понятия
Горизонтальная ось показывает время, обычно в минутах. Вертикальная ось — отклик детектора; у ультрафиолетовых детекторов он выражается в единицах оптической плотности или в тысячных долях этой единицы — миллиединицах (mAU). Нулевая точка графика — момент ввода пробы в колонку.
Время, за которое молекула, совсем не взаимодействующая с колонкой, достигает детектора, называется мёртвым временем. Небольшое колебание в начале графика чаще всего отмечает именно этот момент. До истечения мёртвого времени ни один компонент выйти не может; пики, появляющиеся сразу после него, — это гидрофильные компоненты, почти не удерживающиеся в колонке.
Многие программы наносят на хроматограмму и градиентную программу в виде второй линии. Видеть, при какой доле органического растворителя выходит пик, — значит получить прямое представление о гидрофобности компонента. Однако состав, задаваемый насосом, достигает колонки с некоторой задержкой из-за объёма линий и смесителя системы; при сравнении хроматограмм, полученных на двух разных приборах, эту задержку учитывают.
| Понятие | Как определяется? | Что показывает? |
|---|---|---|
| Время удерживания | Время от ввода пробы до вершины пика | Воспроизводимый в одинаковых условиях признак для идентификации |
| Фактор удерживания | Отношение разности между временем удерживания и мёртвым временем к мёртвому времени | Насколько сильно компонент удерживается в колонке |
| Площадь пика | Площадь под кривой пика | Сигнал, пропорциональный количеству вещества, достигшего детектора |
| Высота пика | Расстояние от базовой линии до вершины пика | Быстрая оценка; для широких пиков менее надёжна |
| Растворимость | Отношение разности времён удерживания двух соседних пиков к их средней ширине | Степень разделения двух компонентов |
| Симметрия | Сравнение передней и задней половин пика | Размывание заднего фронта (хвост) или переднего фронта |
Пик, площадь и высота
Идеальный пик напоминает симметричную колоколообразную кривую. Площадь пика связана с количеством вещества, прошедшего через детектор, и служит основной величиной при количественной оценке. Высота несёт сходную информацию, однако по мере уширения пика то же количество вещества даёт более низкий пик; поэтому высоту рассматривают как упрощённый способ, пригодный для узких и правильных пиков.
Расчёт площади называется интегрированием и выполняется программным обеспечением. Программа по собственным параметрам решает, где начинается и заканчивается базовая линия и где проходят границы пика; при изменении параметров из одной и той же хроматограммы можно получить разные значения площади. Два распространённых варианта, дающих разный результат, — провести вертикаль между слившимися пиками или отделить малый пик от склона большого касательной. Указание ручных корректировок в отчёте — часть надлежащей практики.
Почему процент площади — не массовый процент?
Часто встречающийся в отчётах процент площади — это отношение площади каждого пика к суммарной площади. Его не следует читать как массовую долю компонентов, поскольку отклик детектора на каждый компонент разный. При измерении на 280 нанометрах пептид, богатый триптофаном и тирозином, даёт сильный сигнал, пептид с небольшим числом этих остатков выглядит слабым, а пептид, совсем их не содержащий, почти не виден. Причины выбора длины волны объяснены в статье о 280 nm. Для определения абсолютного количества необходима калибровка по чистому стандарту соответствующего компонента.
Качество разделения
Если сигнал между двумя соседними пиками опускается до базовой линии, компоненты разделены полностью. Обычно это условие считается выполненным, когда разрешение составляет около 1,5 и выше. При меньших значениях пики перекрываются, и их площади влияют друг на друга.
Симметрия также говорит о состоянии разделения. Пики с затянутым задним фронтом (хвостом) чаще всего указывают на нежелательные вторичные взаимодействия компонента с поверхностью колонки или на её износ. Размывание переднего фронта связывают с перегрузкой колонки или с приготовлением пробы в неподходящем растворителе. Плечо на склоне пика часто является следом второго, неразделённого компонента.
В системах с диодно-матричным детектором, сравнивая спектры, снятые от начала до конца пика, можно получить дополнительное представление о том, состоит ли пик из одного компонента. Эта проверка — полезная подсказка, однако её может быть недостаточно, чтобы различить пептиды с очень похожими спектрами.
Пошаговое чтение
- Прочитайте описание метода: колонка, градиентная программа, длина волны и объём вводимой пробы.
- Изучите холостой прогон: пики, появляющиеся при градиенте без пробы, происходят из растворителя или системы и пробе не приписываются.
- Определите мёртвое время и исключите сигнал до него из оценки.
- Следите за базовой линией: небольшой дрейф по ходу градиента — нормальное явление, резкие скачки — нет.
- Подсчитайте пики; не считайте пиками колебания, которые заметно не превышают уровень шума.
- Оцените разделение соседних пиков, симметрию и наличие плеч.
- Рассматривайте таблицу площадей вместе с параметрами интегрирования.
- Наложите хроматограмму на референсную, полученную тем же методом, и сравните их.
Распространённое правило для порога шума: уровень, при котором сигнал превышает шум примерно в три раза, считают пределом обнаружения, а в десять раз — пределом надёжного количественного определения.
Чтение профиля яда
В пробе яда, содержащей десятки компонентов, хроматограмму читают скорее целиком, как отпечаток пальца, чем по отдельным пикам. При анализе нашей референсной партии обращённо-фазовое разделение выполнено в градиенте, где доля органического растворителя возрастала от нуля до шестидесяти процентов, и при 280 нанометрах были разрешены 37 белков и пептидов. При сравнении двух партий сопоставляют не столько число пиков, сколько времена удерживания основных пиков и их относительные площади; небольшие сдвиги отдельного пика чаще всего остаются в пределах вариабельности метода.
Хроматограмма разделяет компоненты, но не называет их. Какому пептиду соответствует пик, устанавливают дополнительными методами, такими как масс-спектрометрия. Результаты наших партий и условия методов публикуются на странице анализа.
