Рекомбинантный токсин — это полученная в лаборатории копия пептида, который в природе вырабатывается в ядовитой железе животного; её получают, перенося кодирующий пептид ген в организм-хозяин — бактерии, дрожжи или культуру клеток. Цель такого подхода — получить отдельный компонент яда в нужном количестве и с определённой чистотой, не завися от природного источника.
Пептиды яда скорпиона — небольшие, но структурно чувствительные молекулы; их правильное сворачивание зависит от нескольких дисульфидных связей. В статье объясняется, как устроено рекомбинантное получение, чем оно отличается от химического синтеза, с какими трудностями сталкиваются при работе с этими пептидами и почему природный яд сохраняет своё место в исследованиях.
Как устроено рекомбинантное получение?
Сначала определяют аминокислотную последовательность пептида; чаще всего для этого используют масс-спектрометрию и генетические исследования ядовитой железы. Ген, соответствующий последовательности, синтезируют искусственно, встраивают в ДНК-вектор и вводят в клетку-хозяина. Пептид часто получают вместе с короткой меткой, облегчающей очистку; затем метку отщепляют специальным ферментом. По мере размножения клеток они производят и пептид; затем его выделяют из клеток или питательной среды, очищают и подтверждают его идентичность.
| Хозяин | Сильная сторона | На что обратить внимание |
|---|---|---|
| Бактерия Escherichia coli | Быстро, дёшево, высокий выход | Дисульфидные связи часто образуются неправильно; пептид можно получить в виде слитого белка и затем отщепить |
| Дрожжи (например, Pichia pastoris) | Могут секретировать пептид в среду; сворачивание может быть лучше, чем в бактериях | Получение занимает больше времени |
| Клетки насекомых и млекопитающих | Обработка сложных белков, близкая к природной | Дорого и медленно |
Отличие от химического синтеза
Короткие пептиды можно получать и без переноса генов — твердофазным пептидным синтезом, при котором аминокислоты последовательно присоединяются друг к другу на твёрдом носителе. За разработку этого метода Роберт Брюс Меррифилд получил Нобелевскую премию по химии 1984 года. При химическом синтезе с удлинением цепи небольшие потери на каждом шаге накапливаются, и выход снижается. Токсины скорпионов — короткие цепи из нескольких десятков аминокислот, причём токсины калиевых каналов обычно короче токсинов натриевых каналов. Поэтому используются оба пути: для коротких пептидов и при необходимости ввести неприродную аминокислоту предпочтителен химический синтез, для более длинных цепей и больших количеств — рекомбинантное получение.
Дисульфидные связи — главная трудность
Трёхмерную структуру токсинов скорпиона закрепляют дисульфидные связи между остатками цистеина. В пептиде с шестью цистеинами они теоретически могут соединиться 15 разными способами, и только один вариант даёт природную структуру. Пептид с неправильно замкнутыми связями может иметь иную активность, даже если его последовательность верна. Поэтому после стадии сворачивания полученный пептид сравнивают с природным по схеме связей и активности. Вклад связей в структуру описан в статье о дисульфидных связях.
Один из методов, чаще всего применяемых для сравнения активности, — измерения пэтч-кламп: если действие рекомбинантного и природного пептидов на один и тот же канал близко, получение считается успешным.
Как подтверждают чистоту и идентичность?
Правильность полученного пептида подтверждают несколькими анализами: масс-спектрометрия подтверждает ожидаемую молекулярную массу, обращённо-фазовая ВЭЖХ показывает чистоту, а схему дисульфидных связей подтверждают ферментативным расщеплением и масс-анализом или совпадением времени удерживания с природным пептидом. У части токсинов скорпионов на конце цепи есть модификации, например амидирование; пептид, полученный в бактериях, сам по себе такой модификации не несёт, и при необходимости её вводят отдельно.
Для чего используют рекомбинантные токсины?
- Исследования «структура — функция»: Аминокислоты пептида заменяют по одной, чтобы выяснить, каким участком он связывается с каналом.
- Референсный материал: Однокомпонентный, охарактеризованный пептид можно использовать для сравнения в аналитических методах.
- Меченые пептиды: Пептиды с флуоресцентными или иными метками изучают как способ показать расположение каналов в ткани.
- Ранние этапы разработки лекарств: Лабораторные шаги на пути от яда к лекарству описаны в статье о лекарствах из яда скорпиона.
Почему природный яд по-прежнему нужен?
Рекомбинантное получение подходит для одного компонента с известным названием и последовательностью. Нативный же яд — смесь множества компонентов, значительная часть которых ещё не охарактеризована. В таких областях, как открытие новых пептидов, изучение взаимодействий между компонентами и работы с антивеномами, природный яд остаётся незаменимым источником. Поэтому рекомбинантные и природные источники не соперничают, а дополняют друг друга.
