Большинство небольших пептидов яда скорпиона удивительно устойчивы для своего размера. Главный источник их устойчивости к нагреванию, изменениям pH и расщепляющим ферментам — дисульфидные мостики, соединяющие разные участки цепи. В этой статье рассматриваются химия мостика, его роль в структуре пептида и методы его изучения в лаборатории.
Что такое дисульфидный мостик?
Цистеин, одна из двадцати стандартных аминокислот, несёт в боковой цепи тиольную группу — концевую группу из серы и водорода. Когда два остатка цистеина достаточно сближаются в пространстве, атомы водорода тиольных групп отщепляются в реакции окисления, и между двумя атомами серы образуется ковалентная связь. Возникшую связь сера — сера называют дисульфидным мостиком, а соединённую ею пару цистеинов — цистином.
Мостик может соединять две удалённые друг от друга точки цепи. Благодаря таким связям линейная аминокислотная последовательность фиксируется в определённой трёхмерной форме. Водородные связи и гидрофобные взаимодействия тоже поддерживают сворачивание, но это слабые и легко обратимые взаимодействия; дисульфидный мостик, будучи ковалентным, гораздо прочнее.
В клетке мостики образуются не случайно. Секретируемые белки сворачиваются в особом внутриклеточном компартменте, в окислительной среде, и в этом процессе участвуют вспомогательные ферменты, разрывающие неправильно образованные связи и замыкающие их заново. Клетки ядовитой железы готовят свои пептиды тем же путём и выделяют их в секрет уже в свёрнутом виде.
Дисульфидные мостики свойственны не только ядам. Гормоны вроде инсулина, антитела и многие защитные пептиды также стабилизируют свою структуру этими связями; пептиды ядов пауков и моллюсков-конусов тоже богаты цистеином. Большое число мостиков — общая черта молекул, которые, как правило, секретируются за пределы клетки и должны функционировать в жёстких условиях.
Схема мостиков в токсинах скорпионов
Значительная часть токсинов скорпионов имеет общий каркас, называемый стабилизированной цистеинами α/β-укладкой. В этой структуре короткий спиральный участок соединяется дисульфидными мостиками с двух- или трёхтяжевым β-слоем. Между двумя цистеинами на спирали находятся три остатка, а между двумя цистеинами на β-тяже — один; этот паттерн — одна из сигнатур последовательности, по которым узнают семейство.
| Группа пептидов | Типичная длина | Типичное число мостиков |
|---|---|---|
| Токсины калиевых каналов (α-KTx) | Около 23–43 аминокислот | 3, у некоторых членов 4 |
| Токсины натриевых каналов | Около 60–76 аминокислот | 4 |
| Хлоротоксин | 36 аминокислот | 4 |
Структура и мишени длинноцепочечной группы рассмотрены в статье о токсинах натриевых каналов.
Разбор на примере пептида из референсной партии
Последовательность пептида α-KTx 3.6 из 36 аминокислот, идентифицированного в протоколе референсной партии, — FTNVSCTTSKECWSVCQRLHNTSRGKCMNKKCRCYS. В последовательности шесть цистеинов, расположенных, если считать от начала, в позициях 6, 12, 16, 27, 32 и 34. Между цистеинами в позициях 12 и 16 находятся три остатка, а между цистеинами в позициях 32 и 34 — один; то есть описанная выше сигнатура видна и в этой последовательности.
Для таких пептидов с шестью цистеинами в литературе чаще всего сообщается схема замыкания, при которой первый цистеин связан с четвёртым, второй — с пятым, а третий — с шестым. Однако подсчёт цистеинов в последовательности не доказывает, какой цистеин с каким связан; реальное замыкание можно показать только экспериментальными методами, описанными ниже. В протоколе референсной партии результатов измерения схемы замыкания мостиков нет, поэтому предполагаемая схема здесь не указывается. Содержание протокола приведено на странице анализа.
Как мостики обеспечивают устойчивость?
Несвёрнутая пептидная цепь может принимать бесчисленное множество конформаций; свёрнутое состояние — лишь одна из этих возможностей. Дисульфидные мостики заранее ограничивают число конформаций, в которые цепь может свободно развернуться. Благодаря этому уход от свёрнутой структуры становится энергетически более затруднённым, и молекула дольше сохраняет форму при повышении температуры или изменении условий среды.
Устойчивость к ферментам объясняется той же компактностью. Протеазам, чтобы добраться до расщепляемой связи, нужен гибкий, открытый участок цепи; в небольшом пептиде, плотно упакованном мостиками, таких участков мало. Это свойство облегчает использование пептидов как исследовательских инструментов и придаёт им сравнительную устойчивость при хранении в сухом виде или в растворе.
Слабое место мостиков
Мостики прочны, но не нерушимы. Восстановители разрывают связь сера — сера, возвращая цистеины в состояние свободных тиолов. В лаборатории для этого используют такие соединения, как дитиотреитол, β-меркаптоэтанол или TCEP. В анализе белков это осознанный шаг: восстановление перед SDS-PAGE разрывает мостики и меняет поведение молекулы в геле.
Второй риск — перестановка мостиков. При наличии в среде свободных тиольных групп и повышении pH существующие мостики могут обмениваться со свободными тиолами, и образуются неправильно замкнутые структуры; в кислых условиях этот обмен замедляется. Распространённый приём, позволяющий избежать такой путаницы при анализе, — химическое блокирование свободных цистеинов, то есть их алкилирование.
Как изучают мостики?
- Измерение массы: при образовании каждого мостика отщепляются два атома водорода; поэтому свёрнутый пептид легче восстановленной формы примерно на 2 дальтона на каждый мостик. Для пептида с тремя мостиками разница составляет около 6 дальтон.
- Сравнение с восстановлением: восстановленную и невосстановленную формы одного образца анализируют бок о бок хроматографией или электрофорезом.
- Расщепление без восстановления: пептид расщепляют ферментом с сохранением мостиков; фрагменты, оставшиеся связанными мостиком, показывают, какие цистеины образуют пару.
- Установление структуры: ядерный магнитный резонанс и кристаллография непосредственно показывают трёхмерное расположение мостиков.
Точное измерение разницы масс выполняют методом, описанным в статье о масс-спектрометрии.
Когда количества, получаемого из природного источника, недостаточно, прибегают к химическому синтезу или рекомбинантному производству. Полученную такими путями линейную цепь контролируемо сворачивают в буферах, содержащих восстановленный и окисленный глутатион. В образующейся смеси могут присутствовать изомеры с разной схемой замыкания; правильный изомер выделяют хроматографией и подтверждают, проверяя, элюируется ли он в той же точке при совместном анализе с природным пептидом. Семейство пептидов калиевых каналов и его номенклатура представлены в статье об α-KTx.
