Yüksek performanslı sıvı kromatografisi, kısaca HPLC, bir karışımdaki bileşenleri birbirinden ayırmak ve ayrılan her bileşeni ayrı ayrı görünür kılmak için kullanılan analitik bir yöntemdir. Venom gibi onlarca bileşen taşıyan numunelerde, profil çıkarmanın en yaygın yolu budur.
Yöntem, adındaki yüksek performans ifadesini ince taneli dolgu maddesine borçludur. Tanecikler küçüldükçe ayrım keskinleşir, ama akışa karşı direnç de artar; bu direnci yenmek için yüksek basınçta çalışan pompalar gerekir. Modern sistemlerde pompa, enjeksiyon ünitesi, kolon fırını ve dedektör tek bir akış hattı üzerinde birlikte denetlenir ve tüm koşullar yazılım tarafından kaydedilir.
Çalışma ilkesi
Sistemin kalbi, dolgu maddesiyle sıkıca doldurulmuş bir kolondur. Pompa, hareketli faz adı verilen çözücüyü yüksek basınçla bu kolondan geçirir. Numune akışa enjekte edildiğinde her bileşen, dolgu maddesiyle (sabit faz) ve çözücüyle farklı güçte etkileşir. Sabit faza daha çok tutunan bileşen kolonda daha uzun kalır, az tutunan önce çıkar. Kolon çıkışındaki dedektör, geçen maddeyi ölçerek zamana karşı bir sinyal çizer; bu grafiğe kromatogram denir.
Kolon sıcaklığının sabit tutulması tekrarlanabilirlik için önemlidir; sıcaklık değiştiğinde bileşenlerin tutunma davranışı da değişir ve tepeler kayar. Aynı nedenle her çalışmadan önce kolonun başlangıç koşullarında dengelenmesi beklenir. Raporlarda cihaz modelinin, kolon tipinin ve program koşullarının yazılması, sonucun başka bir laboratuvarda tekrar edilebilmesi içindir. Referans parti analizinde ayrım, bir Shimadzu Prominence-i LC2030 3D sistemiyle yapılmıştır.
Ters faz ne demek?
Klasik düz faz kromatografide sabit faz polar, hareketli faz apolardır. Ters fazda (RP-HPLC) bu ilişki tersine çevrilir: sabit faz, silika yüzeyine bağlanmış uzun hidrokarbon zincirleriyle apolar hâle getirilir, hareketli faz ise sulu ve polardır. Böylece ayrım, moleküllerin hidrofobikliğine göre yapılır. Peptidler suyu seven ve sevmeyen yüzeyler taşıdığı için bu yaklaşım peptid analizinde standart hâline gelmiştir.
Uygulamada hareketli faz tek bileşimde bırakılmaz. Başlangıçta ağırlıklı olarak su bulunur; zaman içinde organik çözücünün oranı kademeli artırılır. Gradyan elüsyon denen bu yöntemde hidrofilik bileşenler erken, hidrofobik olanlar geç çıkar ve geniş bir polarite aralığı tek çalışmada taranır. Referans parti analizinde ters faz kolonu ile düşük gradyan uygulanmış, organik çözücü oranı yüzde sıfırdan altmışa yükseltilmiştir.
Dedeksiyon neden 280 nm?
Proteinler ve peptidler, yapılarındaki triptofan ve tirozin kalıntıları nedeniyle 280 nanometre dolayında ışık soğurur. Bu dalga boyunda okuma yapmak, tampon bileşenlerinden gelen gürültüyü sınırlarken protein içeren tepeleri seçici biçimde görünür kılar. Soğurmanın fiziği 280 nm ölçümü yazısında ele alınmıştır.
Bir çalışmanın adımları
- Numune tartılır ve uygun çözücüde belirli konsantrasyonda hazırlanır; referans parti analizinde numune 1000 ppm olarak çözülmüştür.
- Çözelti süzülerek partikül giderilir; kolonun tıkanmaması için bu adım atlanmaz.
- Kolon, başlangıç koşullarında dengeye getirilir.
- Numune enjekte edilir ve gradyan programı başlatılır.
- Dedektör sinyali kaydedilir, tepeler alıkonma süresi ve alan üzerinden değerlendirilir.
- Gerekirse tepeler ayrı ayrı toplanır ve sonraki analizlere aktarılır.
Numune hazırlama, sorunların büyük bölümünün kaynağıdır. Çözünmeden kalan tanecikler kolonun girişini tıkar, uygun olmayan çözücü ise tepe biçimini bozar. Bu nedenle numune, hareketli fazın başlangıç bileşimine yakın bir çözücüde hazırlanır ve enjeksiyondan önce süzülür. Enjeksiyon hacminin kolona göre makul tutulması da tepelerin genişlemesini önler.
Kromatogram ne söyler?
| Ölçüt | Anlamı |
|---|---|
| Alıkonma süresi | Bileşenin kolondan çıktığı an; aynı koşullarda tekrarlanabilir bir kimliktir |
| Tepe alanı | Bileşenin göreli miktarıyla ilişkilidir |
| Tepe sayısı | Ayrıştırılabilen bileşen sayısını gösterir |
| Tepe genişliği | Ayrım verimi ve kolon durumu hakkında bilgi verir |
| Taban çizgisi | Kayması sistem ya da gradyan kaynaklı sorunlara işaret eder |
Referans parti analizinde 280 nm'de 37 protein ve peptid çözünürlenmiştir. Bu sayının koşula bağlı olduğunu unutmamak gerekir: kolon tipi, gradyan eğimi ve dedeksiyon dalga boyu değiştiğinde aynı numuneden farklı sayıda tepe elde edilebilir. Kromatogram okumanın ayrıntısı kromatogram yazısında anlatılıyor.
Tepe alanları çoğu zaman göreli olarak değerlendirilir. Bir bileşenin miktarını mutlak olarak vermek için, aynı bileşenin bilinen derişimlerde hazırlanmış çözeltileriyle kalibrasyon yapmak gerekir. Venom bileşenlerinin çoğu için saf standart bulunmadığından profil, nicel bir ölçümden çok karşılaştırmalı bir parmak izi olarak kullanılır.
Ayrılan tepeler yalnızca izlenmekle kalmaz, toplanabilir de. Kolon çıkışındaki akış zamana göre ayrı kaplara alındığında her tepe kendi fraksiyonu hâlinde elde edilir. Bu fraksiyonlar dondurularak kurutulup saklanabilir ve sonraki analizlerde tek bileşen gibi çalışılabilir. Karmaşık bir karışımda ilgi çeken bir peptidin izole edilmesi çoğunlukla bu yolla başlar. Toplanan fraksiyonun hangi çalışmadan, hangi zaman aralığından geldiği kaydedilmezse fraksiyonun kimliği de kaybolur; bu yüzden toplama planı analiz öncesinde yazılır.
Yöntemin sınırı
HPLC bileşenleri ayırır ama kimliklerini tek başına söylemez. Bir tepenin hangi peptide karşılık geldiğini belirlemek için molekül ağırlığı ve dizi bilgisi gerekir; bu nedenle kromatografi çoğunlukla SDS-PAGE ve kütle spektrometrisi gibi yöntemlerle birlikte kullanılır. Analiz akışımızın tamamı analiz sayfasında özetlenmiştir.
