Patch clamp, tek bir hücrenin zarındaki iyon kanallarından geçen çok küçük elektrik akımlarını ölçmeye yarayan bir elektrofizyoloji yöntemidir. Yöntemi geliştiren Erwin Neher ve Bert Sakmann, tek iyon kanallarının işlevine ilişkin buluşları nedeniyle 1991 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nü almıştır. Bugün iyon kanallarını etkileyen moleküllerin, venom peptidleri de dahil, araştırılmasında temel ölçüm araçlarından biridir.
Akrep venomundaki peptidlerin önemli bir bölümü potasyum, sodyum ya da klorür kanallarına bağlanır. Bir peptidin hangi kanalı, ne kadar güçlü ve ne kadar seçici etkilediği büyük ölçüde patch clamp ölçümleriyle belirlenir. Bu yazı yöntemin temel ilkesini, kullanılan kayıt düzenlerini ve bir ölçümün nasıl okunduğunu genel hatlarıyla anlatıyor.
Yöntemin temel ilkesi
Ucu bir mikrometre mertebesinde olan cam bir mikropipet, iletken bir çözeltiyle doldurulup hücre zarına dokundurulur. Hafif emme uygulandığında cam ile zar arasında çok sıkı bir temas oluşur. Bu temasın direnci gigaohm, yani milyar ohm düzeyindedir ve bu yüzden «gigaseal» olarak anılır. Yalıtım bu kadar iyi olduğunda pipet ucundaki küçük zar parçasından geçen pikoamper düzeyindeki akımlar gürültüden ayırt edilebilir.
Ölçüm çoğunlukla gerilim kenetleme (voltage clamp) düzeninde yapılır: yükselteç zarın gerilimini araştırmacının belirlediği değerde sabit tutar ve bunun için gereken akımı kaydeder. Kaydedilen bu akım, o anda açık olan iyon kanallarından geçen akımın kendisidir. Akım kenetleme (current clamp) düzeninde ise akım sabit tutulur ve zar geriliminin değişimi kaydedilir; bu düzen daha çok sinir hücrelerinin elektriksel davranışını incelemek için kullanılır.
Ölçümde hücre içi ve dışı çözeltilerin bileşimi, sıcaklık ve uygulanan gerilim adımları kayda yazılır. Farklı laboratuvarların sonuçları ancak bu koşullar bilindiğinde birbiriyle karşılaştırılabilir.
Dört temel kayıt düzeni
| Düzen | Nasıl kurulur? | Ne ölçülür? |
|---|---|---|
| Hücreye bağlı (cell-attached) | Pipet zara yapışır, zar bütün kalır | Pipet altındaki birkaç kanalın tek kanal akımları |
| Tüm hücre (whole-cell) | Pipet altındaki zar delinir, pipet hücrenin içine açılır | Hücredeki bütün kanalların toplam akımı |
| İçi dışarıda (inside-out) | Zar parçası koparılır, iç yüzü çözeltiye bakar | Hücre içi tarafa uygulanan maddelerin etkisi |
| Dışı dışarıda (outside-out) | Tüm hücre düzeninden geri çekilerek küçük bir zar parçası elde edilir | Dış yüze uygulanan maddelerin, örneğin toksinlerin etkisi |
Venom peptidleri kanallara çoğunlukla hücrenin dış yüzünden bağlandığı için tarama çalışmalarında en sık tüm hücre düzeni kullanılır: peptid hücreyi çevreleyen çözeltiye eklenir ve akımdaki değişim izlenir.
Venom peptidleri nasıl test edilir?
İncelenecek kanal genellikle kendi geninin aktarıldığı bir hücre hattında üretilir; böylece ölçülen akımın büyük kısmı tek bir kanal türünden gelir. Ardından şu adımlar izlenir:
- Peptid eklenmeden önce kanal akımının kararlı bir temel değeri kaydedilir.
- Peptid artan derişimlerde uygulanır ve her derişimde akımın ne kadar azaldığı ya da değiştiği ölçülür.
- Peptid ortamdan yıkanarak etkinin geri dönüp dönmediğine bakılır.
- Derişim–yanıt eğrisinden, akımı yarıya indiren derişim (IC50) hesaplanır.
- Aynı ölçümler başka kanal alt tiplerinde tekrarlanarak seçicilik belirlenir.
Seçicilik, aynı peptidin farklı kanallardaki IC50 değerlerinin birbirine oranıyla ifade edilir; oran büyüdükçe peptid hedef kanalı diğerlerinden o ölçüde ayırt eder.
Kv1 kanalları üzerine yapılan çalışmalar bu yaklaşımın tipik bir örneğidir: bir α-KTx peptidinin Kv1.1, Kv1.2 ve Kv1.3 üzerindeki IC50 değerleri karşılaştırılarak hangi kanala daha seçici olduğu anlaşılır. Sodyum kanalı toksinlerinde ise akımın azalmasından çok kanalın açılma ve kapanma davranışındaki değişim izlenir; bu ailenin özellikleri sodyum kanalı toksinleri yazısında anlatılıyor.
Otomatik patch clamp ve sınırlar
Klasik patch clamp, deneyimli bir araştırmacının mikroskop altında hücrelerle tek tek çalışmasını gerektirir ve günde ancak sınırlı sayıda kayıt alınabilir. Otomatik patch clamp sistemleri pipet yerine küçük delikleri olan düzlemsel yongalar kullanarak birçok hücreyi aynı anda ölçer; çok sayıda molekülün taranması bu sayede hızlanır.
Sonuçlar yorumlanırken bazı sınırlar akılda tutulmalıdır: hücre hattında üretilen kanal, dokudaki doğal kanaldan farklı davranabilir; peptidin saflığı ve derişiminin doğru bilinmesi IC50 değerini doğrudan etkiler. Bu yüzden ham venomla değil, ayrıştırılmış ve kimliği doğrulanmış peptidlerle yapılan ölçümler daha güvenilir sonuç verir. Ham venomun analitik profili için analiz sonuçları sayfamıza bakabilirsiniz.
