لا يوجد جهاز يقرأ مباشرة كمية البروتين الموجودة في محلول. فالمقيس دائمًا مقدار غير مباشر: في الغالب كمية الضوء الممتص عند طول موجي معين. ولتحويل هذه القراءة إلى تركيز بالمليغرام تلزم قاعدة تحويل، وتلك القاعدة هي المنحنى المعياري.
والمنحنى المعياري خط مرجعي يُحصل عليه بقراءة محاليل ذات تراكيز معلومة. وتجد قراءةُ العيّنة المجهولة ما يقابلها على هذا الخط. وتبدو الطريقة بسيطة، غير أن موثوقية النتيجة معلّقة كليًا بكيفية بناء المنحنى.
وتُستخدم في تحديد البروتين مقاربات عديدة. فبعضها يستعمل صبغة يتغير لونها عند ارتباطها بالبروتين؛ وبعضها يقوم على اختزال أيونات النحاس بوجود البروتين؛ أما أقصر الطرق فقراءة امتصاص المحلول في المنطقة فوق البنفسجية. وأيًّا كانت الطريقة المختارة، تلزم معايرة تحوّل القراءة إلى تركيز.
كيف تُحضَّر سلسلة المعايير؟
يُحضَّر أولًا محلول بروتين مرجعي معلوم التركيز. ثم يُحصل من هذا المحلول، بتخفيفات متسلسلة، على عدة تراكيز وسيطة تغطي المجال المراد قياسه. وتُصمَّم السلسلة بحيث تتضمن ما دون القيمة المتوقعة للعيّنة وما فوقها؛ فوقوعُ العيّنة خارج المنحنى يعني أن النتيجة قائمة على التخمين.
وتُقرأ المعايير والعيّنة في المذيب نفسه، وفي الظروف نفسها، وفي الجلسة نفسها. فالعمل بمنحنى حُضِّر في يوم آخر ينقل إلى النتيجة انحرافاتٍ مصدرها الجهاز والوسط. ومن الممارسات الشائعة أيضًا قراءةُ كل تركيز أكثر من مرة واستخدامُ المتوسط.
ويُدوَّن كذلك أيُّ بروتين استُخدم معيارًا. والخيار الشائع بروتين مرجعي منقّى وجيد التعريف من حيث التركيز. ومن المعلوم أن المرجع لا يسلك سلوك بروتينات العيّنة سلوكًا مطابقًا؛ ولهذا تُقرأ النتيجة بوصفها قيمة مكافئة معبَّرًا عنها بحسب المرجع المختار.
من المنحنى إلى المعادلة
تُعلَّم القراءات بحيث يكون التركيز على المحور الأفقي والامتصاص على المحور الرأسي. ويُحسب بالانحدار الخطي أنسبُ مستقيم يمر بالنقاط. والنتيجة معادلة على الصورة التالية:
y = الميل × x + التقاطع
فـ y هنا هو الامتصاص المقروء، و x هو التركيز المطلوب. وتوضع قراءة العيّنة في المعادلة ويُحلّ x فيُوجد التركيز؛ ثم يُضرب في نسبة التخفيف إن وُجدت. ومن المعتاد أن تكون قيمة التقاطع مخالفة للصفر، ويعود ذلك في الغالب إلى أن قراءة الشاهد لا تخرج صفرًا تمامًا.
وتكرارُ القياس جزء من الموثوقية أيضًا. فإجراء أكثر من قراءة لكل معيار ولكل عيّنة يمنع خطأ سحب واحدًا من جرّ النتيجة. وإذا كان الفرق بين القراءات أكبر من المتوقع، تُراجَع خطوات التحضير قبل قبول المنحنى.
ماذا تدل عليه قيمة R²؟
يبيّن معامل التحديد مدى انطباق النقاط على المستقيم المحسوب. وكلما اقترب من الواحد تحسّن التوافق. وفي الممارسة المختبرية تشير القيمة المرتفعة إلى أن سلسلة المعايير حُضِّرت تحضيرًا سليمًا وأن القياس أُجري في المجال الخطي.
ومع ذلك فهو ليس معيارًا كافيًا وحده. فالقيمة المرتفعة لا تنفي احتمال أن تكون المعايير قد حُضِّرت بتراكيز خاطئة؛ إنما تقول إن النقاط متسقة فيما بينها. ولهذا يُجرى التقييم بالنظر إلى رسم المنحنى أيضًا: فانحناءُ النقاط عند الطرفين يدل على تجاوز المجال الخطي.
| البند | ما يقابله في تقرير الدفعة المرجعية |
|---|---|
| معادلة المنحنى المعياري | y = 0.0011x + 0.1726 |
| معامل التحديد | R² = 0.9903 |
| تركيز البروتين المتحصَّل | 28 mg/mL |
| مكان إجراء القياس | مختبر مستقل خارج المنشأة |
والقيم الواردة في الجدول تخص دفعة واحدة. فالقياس يُعاد لكل دفعة وقد تتغير النتيجة بحسبها؛ ولهذا يُقرأ التقرير بوصفه بطاقةَ عيّنة بعينها، لا خاصيةً ثابتة للمنتج.
وتجديد المنحنى على فترات محددة جزء من الممارسة الجيدة أيضًا. فالعمل بمنحنى بُني منذ زمن بعيد يعني افتراض أن الجهاز والمحاليل لم تتغير منذ ذلك اليوم. ولهذا تُحفظ أيضًا سجلات شروط حفظ المحاليل المعيارية وتواريخ انتهاء صلاحيتها.
مزالق متكررة
- قراءة خارج المجال: إذا تجاوز امتصاص العيّنة الحدَّ الأعلى للمنحنى صارت النتيجة غير موثوقة؛ فتُخفَّف العيّنة ويُعاد القياس.
- اختيار الشاهد: يجب أن يُجرى قياس الشاهد بالمذيب نفسه المستخدم مع العيّنة؛ فالمذيب المختلف يزيح قيمة التقاطع.
- المواد المتداخلة: مكوّنات المحلول المنظِّم والمنظفات والعوامل المختزلة قد تؤثر في القراءة بحسب الطريقة.
- اختلاف البروتين المرجعي: النتيجة يُعبَّر عنها بحسب البروتين الذي بُني به المنحنى؛ ومرجعٌ مختلف قد يعطي قيمة مختلفة.
- خطأ التخفيف: في التخفيفات التي تُجرى بأحجام صغيرة ينعكس خطأ السحب على النتيجة مباشرة.
وكيفيةُ الإبلاغ عن النتيجة مهمة أيضًا. فالتركيز يُعطى في الغالب بالمليغرام في المليلتر؛ وعند طلب كمية البروتين الكلية تُضرب هذه القيمة في الحجم. ويتضمن التقرير إلى جانب الرقم الطريقةَ والبروتينَ المرجعي المستخدم وظروفَ القياس. وبدون هذه المعلومات لا يمكن مقارنة نتيجة مختبرين مقارنة مباشرة.
أين تُستخدم النتيجة؟
تركيز البروتين، فضلًا عن كونه رقمًا بذاته، مُدخَلٌ للتحاليل اللاحقة. فبحسب هذه القيمة يُحدَّد مقدار العيّنة الذي سيُحمَّل على الهلام في الرحلان الكهربائي؛ وتفصيل الطريقة مشروح في مقال SDS-PAGE. أما الأساس الفيزيائي لقياس الامتصاص فقد عولج في مقال UV-Vis.
والقيمة جزء من بطاقة الدفعة أيضًا، ويُبلَّغ عنها في شهادة التحليل مع طريقتها؛ وقراءةُ الشهادة مشروحة في مقال شهادة التحليل. كما أن إجراء القياس خارج المنشأة في مختبر مستقل يحمل وزنًا خاصًا في تقييم النتيجة. وتُنشر نتائجنا على أساس الدفعة في صفحة التحليل.
