В протоколе анализа пептида сведения о последовательности чаще всего выглядят как длинная цепочка букв без пробелов. Эта строка, кажущаяся на первый взгляд шифром, на самом деле — простая запись: каждая буква обозначает аминокислоту, а порядок букв — порядок остатков в цепи. В этой статье рассказывается, как читать такую строку и какую информацию она даёт.
Как сведения о последовательности получают в лаборатории, рассмотрено в статье о масс-спектрометрии. Здесь речь идёт о чтении уже полученной последовательности.
Почему одна буква?
Для аминокислот существуют две традиции записи. Трёхбуквенные сокращения напоминают само название и удобочитаемы в коротких записях. Однобуквенные коды разработаны для того, чтобы длинные последовательности помещались в одну строку. Запись белка из сотен остатков трёхбуквенными кодами утроила бы число строк; поэтому базы данных, публикации и протоколы анализа используют однобуквенную запись.
Выбор букв не вполне произволен. Большинство аминокислот получает первую букву своего (английского) названия. Если на одну букву претендовало несколько названий, первую букву получала наиболее распространённая аминокислота, а остальным присваивались буквы, напоминающие произношение или структуру. Поэтому некоторые коды приходится запоминать.
| Код | Аминокислота | Код | Аминокислота |
|---|---|---|---|
| A | Аланин | M | Метионин |
| R | Аргинин | F | Фенилаланин |
| N | Аспарагин | P | Пролин |
| D | Аспарагиновая кислота | S | Серин |
| C | Цистеины | T | Треонин |
| E | Глутаминовая кислота | W | Триптофан |
| Q | Глутамин | Y | Тирозин |
| G | Глицин | V | Валин |
| H | Гистидин | K | Лизин |
| I | Изолейцин | L | Лейцин |
Используется и несколько букв, которых нет в списке. X означает, что остаток в данной позиции не определён. Буквы B, Z и J зарезервированы для неразличимых пар остатков; например, лейцин и изолейцин в некоторых условиях измерения неразличимы, и тогда может использоваться общий код.
Направление чтения и нумерация
Два конца пептидной цепи различаются. На одном конце находится свободная аминогруппа, на другом — свободная карбоксильная группа; их называют N-концом (аминоконцом) и C-концом (карбоксильным концом). Последовательности всегда записывают от N-конца к C-концу. Это правило создаёт общую основу, необходимую для сравнения двух последовательностей.
Номера позиций присваиваются в том же направлении: первым считается остаток на N-конце. Сведения о позициях в протоколе читают согласно этой нумерации. Например, пептид, идентифицированный в нашей референсной партии, имеет длину 36 остатков и несёт шесть цистеинов; позиции этих цистеинов в последовательности указывают, где могут образовываться дисульфидные мостики. Роль мостиков в структуре описана в статье о дисульфидных мостиках.
В нумерации есть подвох. Белок может синтезироваться в клетке в виде более длинного предшественника и затем расщепляться; в этом случае первый остаток зрелой молекулы соответствует другому номеру в последовательности предшественника. При сравнении сведений о позициях из литературы проверяют, по какой последовательности велась нумерация.
Что можно прочитать по последовательности?
Последовательность содержит первые подсказки о поведении молекулы. По характеру остатков можно сделать следующие выводы:
- Длина: число букв равно числу остатков. Поскольку каждый остаток в среднем добавляет около 110 дальтон, можно оценить и приблизительную массу.
- Число цистеинов: количество букв C задаёт верхний предел числа возможных дисульфидных мостиков.
- Тенденция заряда: K, R и H несут основные, а D и E — кислые боковые цепи. Их соотношение даёт представление о поверхностном заряде молекулы и влияет на её поведение в хроматографии.
- Поглощение: присутствие W и Y — причина, по которой возможно измерение при 280 нанометрах; подробности — в статье о 280 nm.
- Чувствительные остатки: M и W сравнительно склонны к окислению, а N и Q — к структурным изменениям.
Отдельного внимания заслуживают остатки пролина: этот остаток ограничивает гибкость цепи и потому часто соответствует точке поворота при сворачивании. Глицин, напротив, как остаток с наименьшей боковой цепью придаёт цепи локальную свободу. Расположение этих двух букв в последовательности может дать приблизительное представление о том, где структура изгибается.
Ни один из этих выводов не даёт трёхмерной формы молекулы. Последовательность — это порядок звеньев цепи; то, как цепь сворачивается и связывается с мишенью, изучают другими методами.
Сравнение двух последовательностей
Когда идентифицирован новый пептид, первым делом его последовательность сравнивают с известными. Сравнение ведут, выравнивая две последовательности буква за буквой; при необходимости вставляют пропуски, чтобы совместить сходные участки. Результат описывают двумя показателями: идентичность — доля позиций, в которых стоит одна и та же буква, и сходство — более широкий показатель, учитывающий также разные, но близкие по свойствам остатки.
В пептидах яда наиболее информативная часть выравнивания — позиции цистеинов. У пептидов одного семейства число остатков между цистеинами образует определённый паттерн, и этот паттерн может указывать на принадлежность к семейству даже при низком сходстве последовательностей. Поэтому классификация учитывает не только процент сходства, но и сохранность паттерна. Номенклатура семейств описана в статье об α-KTx.
Как читать сведения о последовательности в протоколе
Строка последовательности в протоколе сама по себе не является удостоверением личности. В комплексе оценивают, каким методом получена последовательность, прочитана ли она целиком или частично и есть ли неопределённые позиции. Совпадение с базой данных — тоже вероятностное утверждение; мера достоверности совпадения должна приводиться в протоколе.
Длина, число цистеинов и класс пептида, идентифицированного в протоколе по нашей референсной партии, а также сведения о целевых каналах опубликованы на странице анализа. Эта идентификация относится к одной партии; состав компонентов измеряется заново для каждой партии.
